基于ICP-MS多元素同时测定的人血清痕量元素分析方法验证及其在血液透析患者痕量元素生物监测中的应用

《Toxics》：Analytical Validation of a Multielement ICP-MS Method for Human Serum and Its Application to Trace Element Biomonitoring in Hemodialysis Patients

　　

摘要专业翻译 人体血清中痕量元素的可靠测定对于临床评估、毒理学调查和人体生物监测至关重要。本研究描述了一种多元素电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）方法的开发与分析验证，该方法采用1%（v/v）硝酸的简易直接稀释程序，用于同时测定人血清中的必需及潜在毒性痕量元素（Ti、V、Cr、Mn、Co、Ni、Cu、Zn、As、Cd、Ba、Bi）。方法验证包括线性、检出限和定量限、残留效应、精密度、正确度、测量不确定度及分析物稳定性评估。校准曲线表现出优异的线性，在各分析物特定的校准范围（0–10、0–50和0–500 μg L?1）内，决定系数（R2）为0.9993至1.0000。重复性范围为0.69%（Cu）至14.5%（Ba），而中间精密度范围为1.32%（Zn）至81.1%（低浓度下的Cd和Bi）。使用认证血清参考物质获得的回收率在评估条件下为55%（V）至206%（Bi）。同时，检出限范围为0.01（V）至0.16（Cu）μg L?1。测量不确定度按照EURACHEM/CITAC和GUM建议进行估算，确定重复性为整体不确定度预算的主要贡献因素。该方法成功应用于健康个体和接受慢性血液透析患者的血清样本。所提出的方法将简单的样品制备与全面的计量学表征相结合，为多元素血清分析及其在痕量元素生物监测研究中的应用提供了实用途径。

论文解读文章

一、研究背景与目的

痕量元素在人体众多生理过程中发挥着重要作用，它们作为蛋白质的结构组分、酶辅因子、信号传导介质以及氧化平衡的调节因子参与生命活动。然而，痕量元素稳态的紊乱可能促进多种病理状态的发生与发展。必需元素如锌（Zn）、锰（Mn）和铜（Cu）的缺乏或稳态改变与生理及抗氧化功能受损相关，而砷（As）、铬（Cr）、钴（Co）和镍（Ni）等潜在毒性元素的过度暴露则可能与氧化应激、炎症和细胞毒性相关。此外，重金属暴露还可对生殖过程产生不良影响，铜参与氧化还原反应可促进活性氧生成和氧化性DNA损伤。

人体生物监测已成为评估营养状况以及环境或职业性痕量元素暴露的重要工具。血清因其反映多种元素的循环组分且可通过临床常规的微创操作获得而被广泛使用。然而，由于血清基质组成复杂、多种分析物浓度极低以及样品采集、储存和制备过程中存在污染风险，血清中痕量元素的测定在分析上仍具挑战性。

在多种分析技术中，ICP-MS因其优异的灵敏度、宽的线性动态范围、低检出限以及单次分析运行中同时定量多种分析物的能力，目前被认为是多元素生物监测的参考技术。碰撞/反应池技术的引入通过减少多原子干扰显著改善了分析性能。然而，ICP-MS测量的可靠性依赖于严格的分析验证。生物基质如血清特别容易受到基质诱导的信号抑制、污染假象、残留效应、仪器漂移以及样品制备过程变异性的影响。

接受慢性血液透析的患者是痕量元素生物监测特别相关的人群。除终末期肾病相关的肾脏排泄功能深刻改变外，这些个体还暴露于多种可改变痕量元素稳态的因素，包括饮食限制、慢性炎症、药物使用、透析膜以及反复接触大量透析液。因此，血液透析人群中既有必需痕量元素的耗竭，也有潜在毒性金属的蓄积。本研究旨在开发、优化并验证一种用于人血清痕量元素测定的多元素ICP-MS方法，验证方案涵盖检出限和定量限、残留效应、精密度、正确度、线性、测量不确定度和分析物稳定性评估，并将验证后的方法应用于慢性血液透析患者和健康对照的临床生物监测研究。

二、研究设计与关键方法

研究人员开发并验证了一种基于直接稀释法的多元素ICP-MS分析方法。方法采用1:10稀释因子，将0.2 mL血清用含1%（v/v）超纯硝酸的超纯水稀释至2 mL。使用Agilent 7700x型ICP-MS，配备MicroMist同心雾化器、石英雾化室和八极杆碰撞/反应池，在氦气碰撞模式（流速4.5 mL min^?1）下运行以最小化多原子干扰。采用⁴⁵Sc、⁷²Ge、¹⁰³Rh和¹⁸⁵Re作为内标进行在线校正。外部校准使用1%（v/v）硝酸中的多元素水相校准标准，校准曲线包含十个浓度水平（0–5000 μg L^?1）。方法验证遵循IUPAC建议和Eurachem指南，评估了线性、检出限（LOD）和定量限（LOQ）、残留效应、重复性、中间精密度、正确度、测量不确定度和分析物稳定性。正确度评估使用ClinChek^?血清对照I级和II级认证参考物质。临床应用中，样本来自西班牙Alcoy的Virgen de los Lirios医院2015至2017年间招募的199名参与者，包括82名健康对照和117名慢性血液透析患者，血液透析患者平均年龄71.7±8.8岁，对照组71.2±13.1岁。

三、研究结果

样品制备的优化。 研究人员评估了1:10、1:20和1:50三种血清稀释因子对分析灵敏度、基质效应和回收率的影响。较高的稀释因子虽降低血清基质负荷，但会降低分析溶液中分析物浓度，可能影响低浓度或超痕量元素的测定。1:10稀释被选为在基质减少和分析灵敏度之间提供最适当整体平衡的最低稀释因子。该方案无需消解步骤，减少了样品处理时间、试剂消耗和外部污染风险，适合高通量分析。

分析性能。 所有校准曲线均表现出优异的线性，每个研究元素的决定系数（R²）大于0.99，残差图未显示系统性偏离线性。LOD范围为V的0.01 μg L^?1至Cu的0.16 μg L^?1，LOQ范围为0.04至0.72 μg L^?1。血清等效LOQ（应用1:10稀释因子换算）范围为V的0.4 μg L^?1至Cu的5.3 μg L^?1。与健康个体报告的血清浓度比较显示，Cu、Zn和Ba的血清等效LOQ远低于中位浓度，分析余量宽裕；Ni、Mn、Cr和As的LOQ更接近中位浓度；Co和Cd的LOQ与中位浓度比值较高。残留效应评估显示，Ti、V、Cr、Mn、Co、Ni、Cu、Zn、Cd和Ba的残留可忽略，约两次冲洗循环（约3分钟）即可使信号恢复基线；而As和Bi表现出明显的记忆效应，需要超过十次冲洗循环（约15分钟）才能恢复基线。

精密度评估。 重复性评估中，Cu（0.69%）、As（1.67%）和Zn（2.00%）的相对置信区间最窄；V（5.19%）、Co（8.03%）、Cr（9.70%）、Ni（11.19%）、Mn（11.53%）、Bi（11.9%）和Ba（14.5%）为中间值。中间精密度评估中，Zn（1.32%）、Cu（1.90%）和As（4.12%）最低，V（5.79%）也较窄；Ba（8.97%）、Mn（9.94%）、Ni（15.3%）和Co（19.9%）较宽；Cr（30.3%）、Cd（79.1%）和Bi（81.1%）最大。总体上，高浓度元素的相对置信区间较窄，低浓度元素较宽。

正确度评估。 使用ClinChek^?血清对照I级和II级在两个浓度水平和短期、长期条件下评估正确度。Cu、Zn、As和Cd的回收率最为一致，基本接近认证值；V、Cr、Co和Ni在至少一个浓度水平接近预期值；Ba表现出一致的负偏差，两个浓度水平和测量期间的回收率约为67–70%；Bi在I级水平偏差较大，在II级水平回收率接近100%。采用Linsinger统计方法评估正确度，大多数评估条件下实验值与认证值之差低于两倍相关标准不确定度，符合预定正确度标准。

不确定度评估。 测量不确定度按照EURACHEM/CITAC指南和GUM建议估算，不确定度预算包括校准、重复性和正确度三个主要来源。重复性是大多数分析物综合不确定度预算的最大贡献因素，校准相关的不确定度贡献极小，正确度贡献相对较小。锌和铜等血清浓度较高的元素表现出最低的扩展不确定度，而钴、镍和铬等超痕量浓度元素的不确定度较高。

分析物稳定性。 在八个月期间对合并血清样本进行六次分析，评估冻融循环对测定浓度的影响。高浓度元素在整个研究期间无明显浓度变化，但Cu和Zn随储存时间延长呈下降趋势，表明长期储存可能造成这些元素溶解组分的轻微损失。短期稳定性良好，溶解态金属种类在约三个月内保持稳定。因此应避免对拟用于痕量元素测定的血清样本进行反复冻融。

与已发表方法的比较。 与已发表的多元素ICP-MS方法相比，本方法结合了直接血清稀释（1:10，1% HNO₃）、12种元素同时测定和全面的分析验证。与基于酸消解或微波消解的方法不同，本方法只需最少样品处理和0.2 mL血清。完整工作流程包括血清稀释和ICP-MS分析，每小时可处理约20个样品。本研究的LOD（0.01–0.16 μg L^?1）与多种已验证方法相当，同时避免了消解步骤，减少了样品操作、试剂消耗和潜在污染源。

方法在人体血清样本中的应用。 将验证后的方法应用于健康对照和慢性血液透析患者的血清样本。血液透析患者的Cr、As、Ni和Co血清浓度高于对照组，其中Cr和Ni的差异尤为显著。Cr的四分位距在血液透析患者中为3.51–9.68 μg L^?1，对照组为0.02–1.34 μg L^?1；Ni相应范围为2.45–6.63 μg L^?1和0.02–0.50 μg L^?1。As在血液透析患者中也较高（4.11–19.09 μg L^?1 vs. 0.99–5.53 μg L^?1），Co同样较高（0.37–0.76 vs. 0.19–0.38 μg L^?1）。相反，血液透析患者的Zn血清浓度较低（530.50–724.10 μg L^?1 vs. 724.30–861.30 μg L^?1）。V、Cu、Mn和Ba的分布在两组间重叠较大。从分析角度看，Ni有25%的测量值低于LOD，Cr为13%，As和V为5%，Ba为0.5%。

四、讨论与结论

讨论部分指出，直接稀释结合1%（v/v）HNO₃在基质减少和分析灵敏度之间提供了适当折中。1:10稀释的较高残余血清基质需要在长分析序列中特别关注冲洗程序。分析灵敏度具有元素依赖性，对高浓度元素灵敏度尤为有利，而超痕量元素的测定需更加谨慎。精密度同样具有元素依赖性，中间精密度与重复性大体相当，表明跨天测量未引入主要额外变异来源。正确度评估与不确定度评估相结合的重要性通过Ba的案例得到说明——其约67–70%的回收率在考虑相关不确定度后并未构成与认证值的统计学显著差异。重复性作为不确定度的主要贡献因素，表明未来改进应聚焦于提高短期测量精密度。稳定性研究表明，预处理操作可能构成额外变异来源，应标准化储存条件并尽量减少反复冻融。

研究结论指出，稳健的人血清多元素分析不一定需要复杂的样品制备或高度复杂的分析工作流程。通过将简单的直接稀释方案与全面的分析验证和计量学评估相结合，所提出的ICP-MS方法为临床实验室常规测定必需和潜在毒性痕量元素提供了实用可靠的方法。将测量不确定度纳入验证策略是本工作的主要贡献之一，尽管不确定度估算被认为是分析质量的基本组成部分，但在许多已发表的生物基质ICP-MS方法中仍未得到充分解决。这一计量学视角的纳入增强了分析结果的可靠性、可追溯性和可比性，有利于在认可质量管理体系下运行的实验室实施。所提出的验证策略不仅可作为血清痕量元素分析的框架，还可作为ICP-MS程序应用于其他生物基质时开发和验证的方法学模型。