基于切向流过滤的mRNA纯化平台方法：应用于五价诺如病毒疫苗

《Vaccines》：A Platform Approach to mRNA Purification by Tangential Flow Filtration: Application to a Pentavalent Norovirus Vaccine

　　

背景/目的：多价mRNA疫苗正在被评估用于预防由多种流行株引起的诺如病毒感染。平台化的纯化工艺可能通过允许使用通用的下游工作流程处理多个mRNA构建体，从而加速开发并降低制造复杂性。本研究旨在为一种包含来自GI.1、GII.2、GII.3、GII.4和GII.6基因型的五种编码VP1蛋白的mRNA构建体的五价诺如病毒疫苗，开发一种高收率的切向流过滤（TFF）工艺。方法：TFF研究评估了膜截留分子量（MWCO）、跨膜压（TMP）、剪切速率、mRNA载量和工艺放大。工艺性能基于mRNA回收率、完整性、功能性和表观流体动力学尺寸进行评估。结果：尽管VP1构建体具有相似的分子量（590–610 kDa），但使用100 kDa膜的初步研究发现，由于全长mRNA的透出，出现了依赖构建体的损失。表观流体动力学尺寸与观察到的膜筛分行为相关，表明转录本特异的结构特性可能影响膜传输。将膜MWCO从100 kDa降低至50 kDa消除了可检测到的mRNA透出，同时保持了膜性能。4000 s?1的剪切速率支持更高的mRNA载量，且不影响回收率或完整性。由此产生的50 kDa工艺成功地从40 cm2放大到1600 cm2，并在所有五种VP1 mRNA构建体中实现了超过95%的产品收率。结论：这些发现支持了一个为多价mRNA疫苗开发标准化TFF条件的框架。结果表明，单独的转录本分子量和名义膜MWCO可能无法预测mRNA的截留，并证明了通用TFF工艺在五种VP1 mRNA构建体上的适用性。所提出的RNA构象对膜传输的影响需要使用正交结构方法进行确认。

论文解读文章

研究背景与问题

诺如病毒是导致急性胃肠炎的主要原因之一，尤其在儿童和老年人中可引起严重疾病。其遗传多样性极高，主要流行株属于GI和GII基因组群，这给疫苗开发带来了巨大挑战，可能需要能够针对多种毒株的多价疫苗配方。mRNA技术因其抗原序列可快速修改且能保持共同的生产平台而备受青睐。然而，多价mRNA疫苗包含多个序列不同但分子量相近的mRNA构建体，如何建立一个统一的、高效的纯化工艺是一个关键难题。传统的基于分子量的膜选择标准（如膜截留分子量MWCO至少为目标分子量的三分之一）可能不适用于结构复杂的RNA分子。因此，本研究旨在开发一个平台化的切向流过滤（TFF）工艺，用于纯化包含五种VP1 mRNA构建体的五价诺如病毒疫苗。

研究方法概述

研究人员首先合成了六种mRNA疫苗构建体，包括五种诺如病毒VP1 mRNA和一种冠状病毒刺突蛋白mRNA作为对照。主要采用切向流过滤（TFF）技术，结合不同截留分子量（MWCO）的中空纤维膜（100 kDa和50 kDa），通过通量/跨膜压（TMP）扫描实验分析mRNA的筛分行为。利用动态光散射（DLS）测量mRNA的表观流体动力学直径，并通过毛细管电泳（CE）评估mRNA完整性和纯度。此外，还优化了剪切速率和膜载量等关键工艺参数，并在实验室规模（40 cm2）和中试规模（1600 cm2）进行了放大验证。

研究结果

3.1. 使用100 kDa膜对6种mRNA构建体进行TFF纯化

初始实验采用100 kDa中空纤维膜，在低剪切速率和低压条件下运行。结果显示，虽然所有构建体的mRNA完整性和翻译功能均得以保持，但产品回收率存在显著的构建体依赖性差异。GII.3构建体的回收率最高（>90%），而GII.6最低（约70%）。质量平衡分析表明，回收率降低的主要原因是全长mRNA透入渗透液，而非降解。值得注意的是，所有构建体的分子量（590-610 kDa）都远大于膜的标称MWCO（100 kDa），这表明仅凭分子量无法预测膜的截留行为。

3.2. 使用50 kDa和100 kDa中空纤维膜评估mRNA筛分

为了探究意外的构建体依赖性透出，研究人员使用透出最严重的GII.6 mRNA进行了通量/TMP扫描实验。结果表明，100 kDa膜的mRNA筛分系数随TMP升高而显著增加，而50 kDa膜在所有测试条件下均未检测到mRNA透出。毛细管电泳分析证实，透过100 kDa膜的RNA主要是全长mRNA，而非片段。这说明降低膜MWCO可以有效消除产物损失。

3.3. 使用50 kDa TFF优化剪切速率和mRNA载量

使用GII.4 mRNA和50 kDa膜进行优化。研究发现，将剪切速率从2000 s^?1提高到6000 s^?1并未影响产品收率或纯度，但显著提高了渗滤通量。膜载量从10 g/m2增加到20 g/m2也未对工艺性能产生负面影响。因此，研究人员选择了4000 s^?1的剪切速率和高达20 g/m2的膜载量用于后续放大研究。

3.4. 使用选定TFF参数进行中试放大演示

优化的50 kDa TFF工艺成功地从40 cm2放大到1600 cm2。两个规模的膜渗透性曲线高度相似，产品收率均超过95%，mRNA完整性和功能也得到维持。随后，使用中试规模设备对所有五种VP1 mRNA构建体进行了纯化，结果产品收率均超过95%，且相对纯度相当，证明该平台工艺对五种构建体均有效。

讨论与结论

本研究表明，对于这些mRNA构建体，仅凭分子量不足以预测膜截留行为。即使mRNA分子量超出膜标称MWCO约六倍，仍可能发生可测量的筛分，这提示常规用于蛋白质的膜选择标准并不完全适用于结构多样的mRNA。将膜MWCO从100 kDa降至50 kDa消除了产物的透出，表明采用比目标mRNA分子量低十倍以上的MWCO可能是一种更保守的策略。研究还发现，较高的剪切速率（4000 s^?1）不会损害mRNA，反而能提高通量。动态光散射（DLS）测量显示，透出更严重的构建体具有更小的表观流体动力学直径，提示RNA构象可能影响膜传输行为，但这需要进一步的正交结构方法来证实。

结论翻译： 这些发现支持了一个为开发多价mRNA疫苗建立标准化TFF条件的框架。结果表明，单独的转录本分子量和名义膜MWCO可能无法预测mRNA的截留，并证明了通用TFF工艺在五种VP1 mRNA构建体上的适用性。所提出的RNA构象对膜传输的影响需要使用正交结构方法进行确认。