《SCIENCE ADVANCES》：Multiobjective VHH discovery through integrated high-throughput screening and AlphaFold3-guided structural prioritization
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寻找能以高亲和力结合多个相关靶标并具有良好生物物理性质的治疗性抗体仍然具有挑战性且资源密集。对于蛇咬伤抗毒血清（snakebite antivenoms），这一挑战尤为关键，因为治疗必须中和多种蛇种来源的毒素。研究人员开发了一个结合高通量酵母筛选、深度测序和A
寻找能以高亲和力结合多个相关靶标并具有良好生物物理性质的治疗性抗体仍然具有挑战性且资源密集。对于蛇咬伤抗毒血清（snakebite antivenoms），这一挑战尤为关键，因为治疗必须中和多种蛇种来源的毒素。研究人员开发了一个结合高通量酵母筛选、深度测序和AlphaFold3结构预测的流程，用于鉴定针对长链α-神经毒素（long-chain α-neurotoxins）的多特异性重链仅抗体可变域（variable domains of heavy chain–only antibodies, VHHs）。多重酵母展示（multiplexed yeast display）筛选产生了一个具有不同结合特异性的多样化命中数据集。AlphaFold3生成的VHH-毒素复合物预测使研究人员能够对结合多种毒素保守表位的多特异性VHHs进行严格的高精度结构分选，其中代表性亚群经实验证实可阻断毒素与乙酰胆碱受体（acetylcholine receptor, AChR）的结合。这些结构见解为VHHs的亲和力和可溶性表达的计算机优化（in silico optimization）提供了起点，实验验证证实优化后的VHH变体维持了跨毒素的广泛结合特异性。这种整合方法支持对多特异性VHH命中进行结构引导的优先排序，提供了一种高精度过滤器，可能减少未来对广泛实验特异性筛选的依赖，并提供了一个适用于其他治疗背景的框架，在这些背景中抗原变异显著且广泛中和至关重要。
论文解读：整合高通量筛选与AlphaFold3结构优先排序的多目标VHH发现
研究背景与问题
治疗性抗体已成为肿瘤、自身免疫病和感染性疾病等的重要治疗手段，通过特异性靶向并中和疾病相关抗原来发挥作用。尽管实验流程和机器学习等计算方法不断进步，抗体发现与开发仍然耗时且资源密集；尤其当需要在一个目标同源物空间中同时实现亲和力、特异性、减少脱靶结合等多个目标时，往往需要多轮选择。对于蛇咬伤抗毒血清，这一挑战尤为突出。蛇咬伤中毒每年估计导致100,000例死亡，迫切需要改进疗法。重组抗体被认为是传统血浆来源抗毒血清的有前景替代方案，但开发具有广泛物种覆盖的多特异性重组抗毒血清需要鉴定能广谱中和多种蛇毒中毒素同源物保守中和表位的抗体。这里多特异性指跨毒素变体的特异性结合广度，广泛中和指功能抑制广度。此外，候选抗体还应具有高溶解度和热稳定性，以利于长货架期和偏远地区部署；由于蛇咬伤不成比例地影响低收入地区，成本有效的发现和生产方法也很关键。长链三指α-神经毒素（long-chain three-finger α-neurotoxins, LNTxs）常见于眼镜蛇和曼巴等眼镜蛇科蛇类，可结合并抑制乙酰胆碱受体（AChR），导致麻痹和肌肉衰竭，因此是广谱中和抗体的重要靶标。VHH相比全长免疫球蛋白G具有更高稳定性、单位质量更高中和能力和低成本制造潜力，适合此场景。
研究开展与意义
研究人员开发了一个统一的高通量多目标抗体发现流程，将抗体展示技术、深度测序和计算建模整合用于命中鉴定与优化。该流程首先将噬菌体展示和酵母展示结合：噬菌体展示从大型文库中选择结合物，酵母展示实现定量、多重筛选。起始材料为来自全蛇毒免疫骆驼的VHH免疫文库，经一轮针对共识LNTx（cLNTx）的噬菌体展示生物淘选后富集。研究人员以cLNTx、α-眼镜蛇毒素（αCbtx）和α-银环蛇毒素（αBgtx）为抗原，通过多重酵母展示分选多特异性和单特异性VHH，并对分选群体深度测序。随后将AlphaFold3（AF3）系统整合入流程，进行VHH-毒素复合物预测、表位特异性识别、功能区域命中优先排序和跨毒素同源物的计算机多特异性筛选。进一步以AF3结构为起点，用结构信息语言模型优化亲和力、用CamSol优化溶解度，并通过split-luciferase表达和结合实验、生物层干涉测量（BLI）和α7nAChR阻断实验验证。该研究得出结论：整合流程可支持多特异性VHH命中的结构引导优先排序，提供高精度过滤器，减少未来对大量实验特异性筛选的依赖，并为其他抗原变异显著且需要广泛中和的治疗场景提供框架。论文发表在《SCIENCE ADVANCES》。
关键技术方法（不超过250字）
关键方法包括：基于全蛇毒免疫骆驼VHH免疫文库，经一轮针对cLNTx的噬菌体展示生物淘选获得起始富集库；多重酵母展示结合荧光激活细胞分选（FACS）筛选多/单特异性VHH；Illumina深度测序及基于CDR1-CDR3相似性的层次聚类；AlphaFold3复合物预测并以ipTM评分进行高置信结构分选；结构信息语言模型和CamSol进行亲和力与溶解度优化；split-luciferase（NanoBiT/HiBiT）结合和表达筛选；BLI测定结合动力学；DELFIA α7nAChR阻断实验。样本队列来源为全蛇毒免疫骆驼VHH免疫文库，经一轮cLNTx噬菌体展示生物淘选。
研究结果
Multiplexed yeast display and deep sequencing enable high-throughput discovery of poly- and monospecific VHHs against LNTxs。研究人员将一轮cLNTx噬菌体展示生物淘选后的库转入酵母展示，使用cLNTx、αBgtx和αCbtx进行FACS分选。第一轮同时分离cLNTx结合和非结合群体，结合群体从8.75%富集至56.5%，非结合/展示阳性从23.5%至58%。使用αBgtx和αCbtx双荧光标记，富集αBgtx单特异性（0.093%至31.3%）、αCbtx单特异性（7.74%至49.5%）和αBgtx-αCbtx多特异性（1.29%至53.3%）；cLNTx与αCbtx分选富集cLNTx单特异性（1.03%至56.4%）和cLNTx-αCbtx多特异性（6.44%至34.5%），但未能富集αCbtx单特异性。深度测序后，以富集比过滤，基于CDR1-CDR3全局比对距离层次聚类，发现多数簇由单一分选输出主导，表明选择富集了不同CDR1-CDR3序列家族；每个簇随机选取至少两个VHH用于AF3预测。
AF3 enables high-confidence prediction of multiple VHH-toxin complexes。研究人员用先前解析的VHH TPL1158_01_C09（C09）与αCbtx晶体结构（PDB ID: 9GCN）基准评估AF3。该结构在AF3训练数据截止后释放，未作为模板。预测复合物与晶体结构高度一致，RMSD=0.902 ?，DockQ=0.813，CDR3环结合模式相同。对C09与另外四种LNTxs的多特异性及六种非靶标三指毒素诱饵进行评分，使用ipTM>0.8为高置信阈值，所有C09:LNTx复合物均高于阈值，诱饵均远低于阈值。对178个cLNTx结合/非结合序列，AF3预测36个结合者，其中35个来自cLNTx结合群体，精度0.97；对152个αBgtx/αCbtx序列，多特异性预测精度0.86，αBgtx单特异性仅0.04；cLNTx/αCbtx数据集中多特异性精度1.00，单特异性0.60。总体多特异性精度0.93，单特异性0.33；召回率低（多特异性0.24，单特异性0.18）。结论：AF3可作为高精度严格过滤器优先多特异性VHH，但不是全面筛选工具。
AF3 predictions enable epitope characterization and are experimentally confirmed。对AF3真阳性复合物按相应LNTx结构对齐，cLNTx结合复合物揭示两个非重叠表位簇和三种主要VHH结合模式；αBgtx/αCbtx多特异性选择共享单一非重叠表位；αBgtx单特异性和αCbtx单特异性VHH结合同一非重叠表位，但αCbtx单特异性结合模式不同于多特异性。与αCbtx-AChBP晶体结构比较，αCbtx和αBgtx结合VHH的表位与受体结合位点重叠，提示可竞争性抑制毒素与受体结合。多特异性VHH偏好靶向保守残基（67%相同或保守替换，单特异性52%），并避免激进变化（18%对34%）。Split-luciferase测试62个独特VHH对三种毒素结合，定义结合为log
2FC>1，AF3 ipTM>0.8，精度αCbtx 0.90、αBgtx 0.87、cLNTx 0.85，合并0.87；准确度较低，合并0.63。回顾性分析初始cLNTx结合/非结合选择（n=45），AF3对预测结合两种或三种毒素精度0.69–0.82，准确度0.56–0.69。五个CDR3多样性多特异性VHH均剂量依赖抑制αCbtx和αBgtx与人α7nAChR嵌合体结合，包括广谱中和VHH C09作阳性对照。结论：AF3预测表位与功能抑制相关，并获实验证实。
Structure-guided optimization of VHHs。研究人员对19个高置信αBgtx/αCbtx多特异性VHH复合物进行优化。CamSol用于溶解度优化，排除paratope残基以免损害结合；结构信息语言模型用于亲和力优化，分别针对αCbtx和αBgtx设计，仅保留对两者均预测改善的突变以维持多特异性。突变分布于CDR和框架区（FWR），亲和力突变富集于FWR1和FWR3，CamSol突变主要位于CDR3。共筛选37个CamSol设计和57个结构进化（se）设计，split-luciferase显示多个se变体对αCbtx和αBgtx结合信号较野生型提高至四倍；多个CamSol变体表达信号提高，且多数未显著降低对两种毒素的结合。BLI显示所选野生型VHH对两靶标亲和力为7.57至0.62 nM；多数变体亲和力相似或略改善，tp5_se2对αCbtx由0.62至0.40 nM，对αBgtx由4.35至3.62 nM；tp12_se3对αBgtx由7.57至6.20 nM，对αCbtx相当。改善变体的突变位于远离paratope的FWR，提示可能通过改善折叠和/或稳定性提高亲和力。结论：AF3结构可指导靶向优化，但亲和力改善有限，体现上游已获高亲和力。
讨论与结论翻译
讨论部分指出，多目标抗体发现流程正变得必要，传统顺序筛选和优化耗时长。本研究将结构预测和计算机优化嵌入早期发现，证明可并行处理多个目标。多重酵母展示使用差异荧光标记毒素同时选择单/多特异性VHH，深度测序提供覆盖度和模型评估基准。AF3可作为发现流程中的结构过滤器而非事后表征工具；ipTM>0.8给出高精度实验确认结合者，但牺牲灵敏度，许多真结合者低于阈值。回顾性分析提示较低阈值如0.75可恢复更多真结合者且精度略有损失，但数据集有限，0.8仍有文献支持。AF3对多特异性VHH区分功能结合者与非结合者精度高，初始富集后可直接用AF3预测优先多特异性命中；部分多特异性VHH证实剂量依赖抑制αCbtx和αBgtx与nAChR结合，定位为重组抗毒血清潜在先导。单特异性性能较低，反映AF3建模局限及αBgtx和cLNTx单特异性初始筛选标签不完美。严格ipTM阈值重精度轻灵敏度，增加采样和集成方法可能改善多聚体预测。早期结构信息使抗体工程更理性；AF3复合物指导亲和力和溶解度优化，平行split-luciferase筛选快速识别改善设计。许多有益替换位于CDR外，符合结构信息语言模型可优先保持或增强整体复合物稳定性的框架突变。但split-luciferase仅提供相对结合改善，不提供定量亲和力；所选VHH已有亚纳摩尔至低纳摩尔亲和力，限制进一步改善空间，优化阶段主要作为概念验证。挑战包括部分实验验证结合者未获高置信AF3预测，高ipTM不总与正确结合姿态相关，AF3最好作为分选过滤器而非结构准确性保证；VHH和小而结构明确的毒素是有利测试案例，全长抗体和更大更柔性靶标仍困难。
研究结论部分翻译：总之，本研究说明了将结构预测与高通量选择与筛选耦合如何帮助抗体发现从顺序过程转向更并行和预测性过程。通过将多重酵母展示、深度测序、AF3复合物建模和结构引导优化整合到单一工作流中，研究人员为VHHs和其他抗体格式的结构引导优先排序和优化提供了可扩展基础。展望未来，近期使用类似AF3框架对数万VHHs进行的库规模结构谱分析支持本文提出的方法，并展示了通往全库规模分选的路径。新兴开源模型，如Protenix-v2，报告性能优于AF3，可能进一步促进此类流程的更广泛采用。研究人员预计，类似方法不仅可用于重组抗蛇毒血清开发，也可用于需要快速发现具有定制功能和可开发性谱的抗体的治疗、诊断和生物技术应用。
