非洲鼹鼠头固定与自由运动状态下的在体电生理记录方法建立

《Cell Reports Methods》：In vivo electrophysiology in head-fixed and freely moving mole-rats

　　

非洲鼹鼠拥有适应地下生活的感觉和生理特征，数十年来已在实验室中得到研究。然而，其神经生理学仍 largely 未知，且此前缺乏在这些物种中进行在体神经元记录的实验方法。因此，研究人员建立了使用四电极（tetrodes）或Neuropixels探针在清醒、头固定及自由运动的非洲鼹鼠中进行电生理记录的方法。该方法使得研究人员能够研究自然行为（如导航或社交互动）过程中的刺激-反应特征和神经元活动，从而深入理解对完全黑暗生活的神经适应性。

研究背景与意义

长期以来，神经科学主要聚焦于小鼠、果蝇和斑马鱼等模式物种，这虽然带来了重要发现，但其狭窄的研究范围限制了结论的普适性。此外，某些神经科学问题，如对电、磁或红外刺激的特殊感官模态的功能组织，无法通过现有动物模型解答。因此，有必要借助最新技术发展探索更广泛的生物种类。非洲鼹鼠（African mole-rats，Bathyergidae科）是严格的穴居啮齿动物，其与小鼠和大鼠等最常用啮齿类模式动物的最后一个共同祖先可追溯到7000多万年前的白垩纪。在这漫长的进化过程中，非洲鼹鼠获得了对其地下栖息地的非凡适应能力，包括对极端低氧的耐受性、通常复杂的社会结构以及特化的感觉系统。它们退化的视觉和听觉系统，以及对其他感觉模态（如高度发达的触觉和感知地磁场的能力）的依赖，使其成为区别于其他啮齿动物的有趣研究对象。其中，裸鼹鼠（naked mole-rat, Heterocephalus glaber）已成为生物医学研究的模式系统，整个鼹鼠科在探究独特行为和生理特征的神经基础方面具有巨大潜力。

电生理学（Electrophysiology）无需基因修饰即可提供高时间分辨率来研究神经元活动，因此非常适合研究非模式物种的大脑。然而，将这种方法应用于非模式物种常因其独特的解剖学、生理学和行为而面临挑战。本研究介绍了在清醒、头固定和自由运动的非洲鼹鼠（Fukomys anselli 和 Fukomys micklemi）中进行电生理记录的方案。研究人员揭示了鼹鼠生理学的关键组成部分，这些部分需要调整方案以确保手术成功。研究人员创建了一个立体定位脑图谱（stereotaxic brain atlas），并成功从上丘（superior colliculus, SC）和海马（hippocampus）记录了电生理数据。研究结果强调了在为非模式生物建立方案时考虑其生态学的重要性，并为研究鼹鼠非凡适应背后的神经机制铺平了道路。

关键技术方法

1. 1.
   手术与麻醉方案：采用分两步进行的外科手术策略，使用异氟烷（isoflurane）麻醉，以压缩环境空气（约21% O₂）而非纯氧作为载气。术后护理中，使用了优化的镇痛方案（术前单次低剂量丁丙诺啡buprenorphine，术后连续三天每日单次剂量卡洛芬carprofen）。
2. 2.
   术后恢复条件优化：针对鼹鼠特有的KCC2钾氯共转运体突变（R952C），研究人员在术后恢复期将动物饲养在微通风笼具中以升高CO₂浓度，并提供同性别家族成员的陪伴以减少应激和促进体温维持。
3. 3.
   立体定位脑图谱构建：基于两只成年雄性Ansell鼹鼠的Nissl染色冠状切片，创建了包含175张图版、256个标注脑区的立体定位脑图谱，坐标基于前囟（bregma）和人字点（lambda）参考点。
4. 4.
   电生理记录技术：
   • •
     急性记录：使用Neuropixels 1.0探针在头固定的清醒鼹鼠中进行急性记录，同时采集动作电位（AP）和局部场电位（LFP），并施加听觉和视觉刺激。
   • •
     慢性记录：使用四电极（tetrodes）在海马CA1区进行慢性记录，以及使用Neuropixels 2.0探针在后扣带回皮层（RSC）、海马和丘脑进行长期多脑区记录。
5. 5.
   组织学与探针轨迹重建：采用改良的iDISCO⁺组织透明化结合光片显微镜进行三维成像，随后开发了反向透明化（reDISCO）方案，结合振动切片、DAPI和荧光Nissl染色进行二维精细分析。

研究结果

鼹鼠脑部手术

研究人员通过微型计算机断层扫描（μCT）发现，鼹鼠的颞肌（temporalis muscle）显著肥大，覆盖了大部分背侧颅骨，这与小鼠不同。Ansell鼹鼠的颅骨背侧骨骼大多很薄（可薄至126 μm），但有一条随年龄增长而突出的矢状嵴（mid-sagittal ridge）（平均1225 ± 206 μm）。由于代谢率低，研究人员使用异氟烷配合环境空气进行麻醉，并采用两步手术法以缩短单次麻醉时间。术中监测显示，呼吸频率变异大，平均从51次/分钟降至32次/分钟，且会出现短暂呼吸暂停。

术后护理

研究人员发现，标准剂量的阿片类药物（如丁丙诺啡0.1 mg/kg）可导致鼹鼠胃肠道致命性关闭，而多次使用非甾体抗炎药（NSAIDs）会引起胃肠道炎症和出血。最终确定术前单次低剂量丁丙诺啡（0.05 mg/kg）联合术后连续三天每日一次卡洛芬（4 mg/kg）可提供安全有效的镇痛。通过对皮质组织转录组数据的分析，研究人员确认Ansell鼹鼠也存在KCC2蛋白的R952C突变。在实验室正常二氧化碳浓度条件下，该突变易导致术后癫痫发作。通过在微通风恢复笼中提高CO₂浓度（0.14%–0.68%），可有效减少术后癫痫的发生。此外，提供同性别家族成员陪伴对于减轻隔离应激、促进体温维持和提高CO₂水平至关重要。

鼹鼠立体定位脑图谱

研究人员创建了首个Fukomys anselli的立体定位脑图谱，包含175张Nissl染色的冠状切片图版，标注了256个脑区，坐标基于前囟和人字点。该图谱可用于指导电极植入，并作为未来鼹鼠脑部研究的参考。

电生理记录

头固定鼹鼠中的重复急性Neuropixels记录：使用Neuropixels 1.0探针，研究人员成功记录了内侧视皮层（V2M）、后扣带回皮层（RSC）和上丘（SC）的神经元活动。通过高频滤波数据、不同频段LFP功率谱、电流源密度（CSD）分析等方法验证了探针位置的准确性。经自动尖峰分类（Kilosort 4）和手动修正，从两只动物的皮层、SC和中脑导水管周围灰质（PAG）中分离出1210个神经元单元，并在SC中发现了对听觉或视觉刺激有反应的神经元。

自由运动鼹鼠海马的慢性四电极记录：使用四电极在海马CA1区进行记录，研究人员获得了稳定的单单元尖峰数据和LFP。记录的神经元表现出典型的复杂尖峰模式，包括爆发放电（burst firing）和紧张性放电（tonic firing）。LFP频谱分析显示一个显著的θ节律（theta rhythm）峰值，大约在4-5 Hz，低于大鼠和小鼠常见的6-12 Hz范围。

自由运动鼹鼠的慢性Neuropixels记录：使用Neuropixels 2.0探针，研究人员实现了长达四周以上的高质量慢性记录。探针靶向RSC、海马和丘脑。在整个记录期间（最长34天），记录到的神经元数量未见下降，且信噪比（SNR）和幅值保持稳定，证明了NPX 2.0探针用于鼹鼠长期研究的可行性。

组织学

对于四电极，研究人员使用冷冻切片和Nissl染色进行轨迹重建。对于Neuropixels探针，则采用了创新的两步法：首先进行全脑组织透明化（改良iDISCO⁺）和光片显微镜三维成像，然后通过反向透明化（reDISCO）和振动切片进行DAPI染色和荧光显微镜观察，以精确匹配探针轨迹与脑图谱。

讨论与结论

本研究的讨论部分指出，成功建立鼹鼠侵入性脑外科手术方案的关键在于克服其头部解剖学（厚实的颅肌、薄的颅骨）、生理学（低代谢、低体温、KCC2突变导致的癫痫易感性）和社会生态学（社会性需求）方面的独特约束。研究发现，术后恢复期的关键因素包括：使用提升的CO₂环境以补偿KCC2突变带来的兴奋-抑制失衡，以及提供家族成员陪伴以满足其社会性和体温调节需求。

研究结论总结如下：研究人员建立了适用于Fukomys属非洲鼹鼠的外科手术和电生理记录方案，这些哺乳动物独特地适应了地下生活。该方案克服了这些高度特化的穴居哺乳动物在解剖学、生理学和生态学上的限制，使得在头固定和自由运动两种状态下，利用四电极和Neuropixels探针进行急性和慢性电生理记录成为可能。通过创建的立体定位脑图谱，可以精确定位多个脑区。研究展示了在上丘记录到对听觉和视觉刺激有反应的神经元，并在海马CA1区记录到了典型的复杂尖波锥体细胞和低频（4-5 Hz）θ节律。该研究提供的方案为更广泛地应用这些非传统模型来研究哺乳动物大脑功能（特别是在独特生理和行为适应的背景下）奠定了基础框架。