阿根廷皮肤癣菌的物种分布、常规与MALDI-TOF MS鉴定准确性比较、新型多重PCR快速鉴定方法及抗真菌药物敏感性

《Antimicrobial Agents and Chemotherapy》：Dermatophytes in Argentina: species distribution, comparative identification accuracy of conventional and proteomic methods, introduction of a novel molecular identification approach, and antifungal susceptibility profiles

皮肤癣菌病（dermatophytosis）是一种常见的浅表真菌感染，但来自阿根廷的数据仍匮乏。在这项多中心研究中，研究人员对2024年连续收集的127株分离株（isolates）采用形态学、基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS）、内转录间隔区（internal transcribed spacer, ITS）测序以及一种用于快速鉴定的新型多重PCR（multiplex PCR）试验进行分析。优势菌种包括 Trichophyton tonsurans、Trichophyton rubrum 和 Trichophyton mentagrophytes 复合群（complex）。抗真菌试验（CLSI M38）显示种间变异：特比萘芬（terbinafine）活性最强，伊曲康唑（itraconazole）对 Microsporum canis 显示出更好疗效，而氟康唑（fluconazole）活性有限。

引言与背景：皮肤癣菌病（dermatophytosis）是全球最常见的浅表真菌感染，由嗜角质真菌引起，可感染皮肤、毛发和甲，临床表现统称为癣（tinea）。其临床表现因感染菌种、宿主特征和地理区域而异。尽管全球患病率高，南美尤其阿根廷关于皮肤癣菌物种分布和抗真菌药物敏感性数据仍有限。准确及时鉴定皮肤癣菌对指导抗真菌治疗至关重要。传统依赖宏观和微观形态学的鉴定方法固有较慢，且可能缺乏精确性，尤其对 Trichophyton mentagrophytes/Trichophyton interdigitale 复合群等近缘种。基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS）和核糖体DNA（ribosomal DNA, rDNA）测序提高了鉴定速度和准确性。基于此，研究人员开展多中心研究，分析阿根廷2024年连续收集的127株皮肤癣菌，比较鉴定方法，建立新型分子鉴定方法，并评估抗真菌敏感性。

研究人员开展的研究：研究人员分析2024年1月至9月从阿根廷诊断为皮肤癣菌病患者中连续收集的127株皮肤癣菌分离株。样本来自布宜诺斯艾利斯两家医院，以及位于布宜诺斯艾利斯和圣菲市的两个学术实验室。男女患者均纳入。与分离株相关的临床诊断包括甲癣（tinea unguium，26.3%）、足癣（tinea pedis，23.7%）、头癣（tinea capitis，21.2%）、体癣（tinea corporis，16.1%）、股癣（tinea cruris，1.7%），11.0%病例临床来源未知。所有分离株经培养、宏观特征和色素产生评估，并进行生理试验和显微镜检查。鉴定采用形态学、表型、生理试验与 MALDI-TOF MS（Bruker Daltonics 和 Shimadzu Axima 系统）、ITS测序以及靶向ITS多态性的新型多重PCR（multiplex PCR）联合策略。多重PCR在三个参与实验室以盲法验证。抗真菌药敏试验按CLSI M38进行，评估氟康唑（fluconazole）、克霉唑（clotrimazole）、特比萘芬（terbinafine）和伊曲康唑（itraconazole），最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration, MIC）三次测定并计算几何均数。研究结论显示，多重PCR与测序100%一致，与MALDI-TOF MS 98.4%一致；该研究提供阿根廷首个大规模抗真菌药敏基线，支持特比萘芬和伊曲康唑作为一线系统药物，提示氟康唑体外效用有限，并强调准确种水平鉴定对 Microsporum canis 等敏感性较低菌种的重要性。

主要关键技术方法：多中心连续样本队列来自2024年1—9月阿根廷布宜诺斯艾利斯两家医院及布宜诺斯艾利斯和圣菲两个学术实验室，共127株皮肤癣菌，男女患者均纳入。关键技术包括形态学与生理/表型试验；MALDI-TOF MS（Bruker Daltonics 与 Shimadzu Axima）；ITS测序；靶向ITS多态性的新型三管式多重PCR，并在三个实验室盲法验证；CLSI M38抗真菌药敏试验，MIC三次测定并计算几何均数。

研究结果：物种分布与鉴定方面，通过综合形态学、蛋白质组学和分子方法，鉴定出 Trichophyton tonsurans（n=38；29.9%）、T. rubrum（n=35；27.6%）、T. mentagrophytes 复合群（n=35；27.6%）、Microsporum canis（n=7；5.5%）、Nannizzia gypsea（n=6；4.7%）、Epidermophyton floccosum（n=5；3.9%）、Microsporum nannum 和 T. benhamiae（各 n=1；0.8%）。形态学和生理学鉴定对大多数菌种与蛋白质组学和分子方法高度一致；但4株（3.1%）仅凭形态学被误分类。两株初判为 T. tonsurans 经测序和多重PCR重分类为 T. rubrum，两株归为 T. mentagrophytes 复合群经 MALDI-TOF MS 重分类为 T. interdigitale 和 T. benhamiae。

多重PCR鉴定性能方面，新型多重PCR采用三管格式，设计为3小时内完成准确种水平鉴定，从而无需测序。该试验与测序显示100%一致性，与 MALDI-TOF MS 显示98.4%一致性。蛋白质组学和分子方法之间少数差异限于 T. mentagrophytes 复合群中动物源性成员 T. interdigitale 和 T. benhamiae，二者具有相同ITS扩增子长度，因此不能仅由所提出的多重PCR可靠区分。基于ITS序列，T. indotineae 预期产生相同模式，但未测试菌株。

抗真菌敏感性方面，按CLSI M38，特比萘芬和伊曲康唑表现出最强体外活性，各皮肤癣菌种MIC值持续较低（分别为0.009–0.250 μg/mL和0.055–0.155 μg/mL）。氟康唑MIC最高（16–128 μg/mL），克霉唑居中（0.096–1.000 μg/mL）。这些MIC谱与阿根廷Misiones先前较小数据集尤其 T. tonsurans 的报道密切相似。种间变异明显：伊曲康唑在所有菌种中MIC低，仅 N. gypsea 轻度增加两倍；特比萘芬对 Trichophyton spp. 高活性，而 M. canis 对该丙烯胺类最不敏感，其比较倍数超过 N. gypsea（4.05倍）、T. rubrum（8.33倍）、T. mentagrophytes 复合群（6.90倍）和 T. tonsurans（13.85倍）。氟康唑高MIC支持其体外疗效降低。值得注意的是，N. gypsea 和 T. benhamiae 对多种药物表现出相对较高MIC，提示敏感性降低，但分析分离株有限。未检测到特比萘芬耐药；然而，因乌拉圭近期报道皮肤癣菌耐药且地理邻近，持续监测是必要的。由于其他菌种分离株数量有限，仅 T. rubrum、T. tonsurans 和 T. mentagrophytes 复合群获得 MIC₅₀ 和 MIC₉₀ 数据。

诊断视角方面，形态学鉴定仍有价值，但可能不足以准确区分种复合群内物种。纳入 MALDI-TOF MS 和分子方法显著改善种水平鉴定。研究人员开发的多重PCR提供主要诊断优势：无需广泛培养产生分生孢子，甚至可在多形性培养中实现种水平鉴定。形态学鉴定需要产孢，虽 MALDI-TOF MS 可在产孢前进行，但其准确性可能随培养年龄和质量变化。相反，PCR试验结果独立于培养时间，从而克服这些限制。该多重PCR在仅生长4天后即成功鉴定，无需产孢或任何表型特征，证明其稳健性和可靠性，显著缩短诊断周转时间并确保可靠鉴定。

讨论与结论：研究人员基于127株连续分离株的大规模多中心数据集和综合鉴定策略，证明新型多重PCR试验具有诊断和临床价值。特比萘芬和伊曲康唑对主要皮肤癣菌种持续低MIC支持其作为阿根廷一线系统药物，而氟康唑高MIC强化其有限效用，此观察需临床试验确认。Microsporum canis 对特比萘芬敏感性降低突出准确种水平鉴定的重要性，多重PCR可快速可靠实现，即使在多形性培养中。研究局限包括缺乏治疗史、抗真菌药物面板有限和罕见菌种代表性不足；但该数据集建立阿根廷首个大规模抗真菌药敏基线。队列中无特比萘芬耐药令人安心，但乌拉圭近期报道强调持续监测的必要性。研究结论翻译：总之，这些发现为临床医生提供可操作指导，优化抗真菌药物选择，并引入一种诊断工具，可缩短至靶向治疗（targeted therapy）的时间，从而有助于优化抗真菌药物选择、改善患者结局，并建立南美洲耐药监测框架。