哈密瓜表面牛源沙门氏菌的存活、生长及其抗生素抗性基因水平转移潜力

《Applied and Environmental Microbiology》：Survival, growth, and potential of horizontal gene transfer of antibiotic resistance genes of bovine Salmonella on the cantaloupe surface

　　

沙门氏菌（Salmonella）疫情暴发常与受污染的哈密瓜相关，细菌多重抗生素耐药现象亦频繁出现。为理解沙门氏菌在哈密瓜表面的生长与存活规律及其在该环境中的抗生素耐药机制，本研究开展了相关探索。研究人员将牛源沙门氏菌分离株接种于哈密瓜表面，在35°C、65–75%相对湿度条件下培养5天。每个分离株与携带辅助质粒RP4-8及可移动质粒pSC27（含卡那霉素、新霉素和氨苄青霉素抗性基因）的供体大肠杆菌（E. coli）CSH56共接种。每份哈密瓜表面施加100 μL沙门氏菌悬液（1 × 108 CFU/mL）和100 μL大肠杆菌悬液（1 × 107 CFU/mL）（比例为1:10）。研究人员在Hektoen琼脂上监测沙门氏菌的存活与生长，在含卡那霉素的Hektoen琼脂上计数转接合子，并在MacConkey琼脂上定量供体大肠杆菌。所有沙门氏菌分离株在5天内均存活并表现出生长，增长幅度为0.94 log10 CFU/mL至3.43 log10 CFU/mL。值得注意的是，所有沙门氏菌分离株均具备在体外及哈密瓜表面接受并整合源自大肠杆菌pSC27质粒序列至其染色体的能力。接合后，携带该质粒的沙门氏菌突变体在体外数量达2.79 log10 CFU/mL。沙门氏菌在哈密瓜表面的存活、生长及水平基因转移对公共卫生构成重大风险。

一、研究背景与意义

沙门氏菌（Salmonella）是全球范围内引起食源性胃肠炎的主要病原菌之一，属于肠杆菌科（Enterobacteriaceae），包含超过2,600种血清型，其中肠炎血清型（Enteritidis）和鼠伤寒血清型（Typhimurium）是多数地区由动物传播至人类的最重要血清型。全球每年约有2,170万例沙门氏菌感染病例，导致216,000人死亡，中低收入发展中国家受影响尤为严重。沙门氏菌感染通常与食用受污染的鸡蛋和鸡肉等食品相关，但水果和蔬菜等农产品同样在传播中发挥作用。2023年，美国疾病控制与预防中心（CDC）报告了美国和加拿大44个州的407例病例，其中6人死亡。过去三十年间，哈密瓜已在多个国家被牵涉进多起沙门氏菌病暴发事件。

哈密瓜在产销过程中受到沙门氏菌污染受多种内在和外在因素影响。内在因素包括哈密瓜表面生物膜形成和有机物积聚，可为细菌生长和存活提供有利环境；外在因素涵盖土壤、灌溉水、有机肥料（可能源自动物粪便）、野生动物粪便、牲畜或人类排泄物污染、采后清洗用水温度以及不当处理操作等。未经处理的牛粪施用构成将致病菌引入农田土壤的重大风险，研究表明沙门氏菌可在土壤中存活90至超过200天，进而污染栽培作物。

哈密瓜果实表面粗糙的网状纹理结构有利于细菌黏附和生物膜形成，使瓜皮去污困难，导致微生物在果实上持续存在。食源性病原菌多重耐药的出现是食品安全和人类健康面临的严重问题，世界卫生组织（WHO）将沙门氏菌列入抗菌素耐药高优先级病原体清单。水平基因转移（horizontal gene transfer, HGT）促进细菌间抗生素抗性基因（antibiotic resistance genes, ARGs）的获取，使细菌获得具有新功能的新基因，在细菌基因组进化中发挥关键作用，导致种群多样化、新表型出现，并影响抗生素耐药性、毒力和环境胁迫适应性。HGT主要通过三种机制发生：转导（transduction）、转化（transformation）和接合（conjugation），其中接合被认为是基因交换的主要促进机制。

鉴于哈密瓜表面病原菌定植和持续存在机制的研究信息有限，且关于该情境下基因组物质转移的数据不足，本研究旨在探究沙门氏菌在哈密瓜表面的存活和增殖能力，并确定在该条件下大肠杆菌（E. coli）向沙门氏菌水平转移抗生素抗性基因的可行性。

二、研究设计与主要发现

研究人员将牛源沙门氏菌分离株（Salmonella 5.2、20.2、28.2，均分离自墨西哥牛粪便）及阳性对照鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028分别接种于哈密瓜表面，在35°C、65–75%相对湿度条件下储存5天，监测各菌株的存活与生长情况。同时，研究人员以携带辅助质粒RP4-8和可移动质粒pSC27（含卡那霉素、新霉素和氨苄青霉素抗性基因）的大肠杆菌CSH56为供体菌，与各沙门氏菌分离株以1:10比例共接种，在体外（营养肉汤）和哈密瓜表面原位条件下考察pSC27质粒向沙门氏菌的水平转移能力。研究还通过全基因组测序（whole-genome sequencing, WGS）对转接合子进行基因组学分析，确认质粒来源序列的整合事件。

研究结果表明，所有沙门氏菌分离株在哈密瓜表面5天内均能存活并生长，但增长幅度呈菌株依赖性。其中分离株BC-NL 5.2增长最为显著，5天内增加3.43 log₁₀ CFU/mL，最终达7.89 log₁₀ CFU/mL；BC-NL 28.2增加2.31 log₁₀ CFU/mL；鼠伤寒沙门氏菌增加1.02 log₁₀ CFU/mL；BC-AG 20.2仅增加0.94 log₁₀ CFU/mL。体外接合实验显示，所有沙门氏菌分离株在1小时和24小时均能被pSC27质粒转化，其中BC-NL 5.2在24小时表现出最高的接合细菌数量（2.79 log₁₀ CFU/mL）和最高的接合频率（8.96 × 10^?4）。在哈密瓜表面原位实验中，所有沙门氏菌分离株均表现出接受pSC27质粒来源序列的能力，但接合效率受菌株和储存时间双重影响：鼠伤寒沙门氏菌在24小时（第1天）达到最高转接合子数量（2.79 log₁₀ CFU/mL），BC-NL 5.2在第2天达到峰值（2.30 log₁₀ CFU/mL），BC-AG 20.2在整个实验期间接合频率持续较低（<0.80 log₁₀ CFU/mL），BC-NL 28.2在第3天达到峰值（1.28 log₁₀ CFU/mL）但仍低于对照组。

全基因组测序分析证实了水平基因转移事件的发生。鼠伤寒沙门氏菌14028转接合子基因组较野生型增加78,996 bp（从4,789,767 bp增至4,868,763 bp），BC-NL 5.2转接合子增加14,683 bp（从4,998,541 bp增至5,013,224 bp）。序列比对确认两个转接合子均整合了pSC27质粒来源的序列，包括bla1、β-内酰胺酶TEM-12、neo1抗性基因以及RSF1010复制起点（oriT）等核心功能区域。基因组相似性分析（OrthoANI）确认BC-NL 5.2为肠炎沙门氏菌（S. enterica）enterica亚种Cerro血清型，该血清型在美国奶牛沙门氏菌分离株中占比超过16%。

三、关键技术方法

本研究采用的主要技术方法包括：哈密瓜表面消毒与分区接种模型（使用氯溶液和UV-C处理）；细菌存活与生长定量（Hektoen琼脂培养结合PCR确认）；体外及原位接合转移实验（以大肠杆菌CSH56(pSC27+RP4-8)为供体，Hektoen^Kan琼脂筛选转接合子）；全基因组测序（Oxford Nanopore MinION平台，经Flye组装、Medaka抛光、Prokka注释）；比较基因组学分析（BLAST比对、Geneious Prime可视化）；以及基于OrthoANI的基因组相似性分析和SISTR血清型预测。

四、讨论与结论

本研究表明，哈密瓜表面粗糙的网纹结构为微生物黏附与存活创造了有利微环境，使常规消毒方法难以实现彻底清洁。哈密瓜在供应链各环节（农场、采摘、集散、储存、分销和零售）常暴露于35°C等较高温度，而美国食品药品监督管理局（FDA）和CDC强调易腐食品应保持在≤4°C并及时冷藏，因为沙门氏菌等病原菌在推荐温度范围外会快速增殖。在标准商业冷藏条件（4°C、95%相对湿度）下，沙门氏菌虽能存活但无法在哈密瓜表面增殖；冷链完整性受损时，较高环境温度可克服热抑制，使沙门氏菌在哈密瓜表面增殖并维持活跃代谢过程，从而促进质粒水平转移。

pSC27质粒属于IncQ群可移动质粒，携带RSF1010区域编码松弛体组分，其转移依赖接合质粒的配对形成（Mpf）系统。尽管pSC27本身不具备自我转移能力，但可通过接合辅助质粒（如RP4-8）编码的IV型分泌系统（T4SS）实现 mobilization，构成抗生素抗性基因传播的重要机制。本研究中，两个转接合子基因组扩张规模差异显著（78,996 bp vs 14,683 bp），表明新鲜农产品表面的水平基因转移并非均一过程，而是由受体菌株的内在基因组可塑性、插入序列密度和局部重组热点共同决定。

研究结论：沙门氏菌能够在哈密瓜表面存活、增殖，并通过水平基因转移将抗生素抗性基因整合至自身染色体。这一发现在35°C、65–75%相对湿度条件下储存5天的哈密瓜表面得到证实，凸显了不当食品储存温度下的潜在风险——沙门氏菌与大肠杆菌等病原菌在食品中的生长和基因转移不仅超出疾病产生本身的影响，还加剧了抗菌素耐药性的快速升级和毒力基因的传播，对公共卫生构成重大威胁。