沙门氏菌噬菌体SF1通过导向选择脂多糖（LPS）缺陷群体使细菌对苯扎氯铵、过氧化氢和三氯生超敏

《Applied and Environmental Microbiology》：A Salmonella phage steers bacterial populations toward hypersensitivity to benzalkonium chloride, hydrogen peroxide, and triclosan

　　

摘要：噬菌体导向（phage steering）是一种新兴抗菌策略，利用噬菌体捕食的进化后果使细菌群体对现有抗菌剂敏感化。尽管噬菌体导向使细菌对抗生素和免疫效应因子超敏已有充分记载，但类似机制能否增强细菌对商业消毒剂的敏感性仍知之甚少。在此，研究人员表明，感染肠道沙门氏菌（Salmonella enterica）的裂解性长尾噬菌体（siphovirus）SF1需要完整的O-抗原层用于吸附和裂解性复制，且具有O-抗原缺陷或更深层脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）缺陷的框内缺失突变体对若干商业消毒剂的敏感性增加。关键的是，SF1在联合试验中增强了所有受试消毒剂的活性，并且与苯扎氯铵（benzalkonium chloride, BAC）、过氧化氢（hydrogen peroxide, H₂O₂）和三氯生（triclosan）表现出数学协同作用，而SF1选择的LPS突变体对这些化合物超敏。这些发现与以下假设一致：SF1不仅作为杀菌剂发挥作用，还作为进化导向工具，通过选择消毒剂超敏表型增强消毒剂活性。广义而言，这些结果支持将噬菌体导向作为把噬菌体部署为商业消毒剂佐剂的有前景策略。

重要性：商业消毒剂对于在整个食品生产和加工链中控制病原体至关重要，但其有效性日益受到细菌耐受和持留的损害。尽管噬菌体正被研究作为直接杀菌剂，但其作为商业消毒剂佐剂的效用仍未被充分探索。在本研究中，研究人员证明，沙门氏菌噬菌体SF1选择LPS缺陷突变体，这些突变体对若干商业消毒剂的敏感性增加。重要的是，研究人员进一步表明，SF1与噬菌体选择突变体对其超敏的消毒剂产生协同作用，支持一种导向介导机制，即噬菌体捕食增强消毒剂活性。据研究人员所知，这是首次报道证明噬菌体导向可作为将噬菌体部署为商业消毒剂协同佐剂的策略。这些发现凸显了利用进化权衡改善食品加工环境中病原体控制的潜在价值。

研究背景：食品生产与加工系统中抗菌剂的广泛使用选择出耐药细菌群体，挑战传统病原控制，并促使开发互补抗菌策略。噬菌体生物防治（phage biocontrol, PB）利用天然、高度特化的杀菌病毒即噬菌体感染并消除细菌病原；近年研究日益关注噬菌体导向（phage steering），即利用噬菌体作为选择剂使细菌群体偏向更易处理的表型，使噬菌体同时作为杀菌剂和增强现有抗菌剂疗效的佐剂。属于Caudoviricetes目的噬菌体能够进行裂解性复制，仅依赖该复制策略者称为专性裂解（obligately lytic, OL）噬菌体，通常被视为生物防治金标准。OL噬菌体捕食对敏感细菌施加显著适合度代价，因此常选择受体缺失或修饰的抗性亚群。由于噬菌体可利用脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）、荚膜成分、菌毛、鞭毛、黏附素、外排泵及其他毒力或抗菌耐药决定因子作为受体，噬菌体捕食可导向毒力减弱和抗菌敏感化表型。沙门氏菌是主要食源性病原，估计每年引起1.5亿例胃肠炎，其中超过三分之一归因于高度流行且强毒的血清型Enteritidis。尽管沙门氏菌最常与禽肉和蛋制品相关，但暴发也涉及新鲜农产品、坚果、糖果等即食食品；污染可发生在食品生产链任何环节，尤其加工和流通期间。因此有效消毒对降低污染风险至关重要，但日益受到细菌持留和对商业消毒剂耐受的削弱。消毒剂耐受还与沙门氏菌的抗菌和金属耐药相关，提示此类群体可能对公共卫生构成更高风险。尽管噬菌体导向使细菌对抗生素超敏已在包括沙门氏菌在内的多个系统报道，但噬菌体驱动选择能否同样增强对商业消毒剂的敏感性仍知之甚少。研究人员因此开展本研究。

关键技术方法：研究使用肠道沙门氏菌肠炎血清型（Salmonella enterica sv. Enteritidis）FSL S5-483，其全基因组序列来自Salmonella Foodborne Syst-OMICS数据库，并以其单基因清洁缺失突变体为对象；噬菌体SF1为既往从牛粪分离的OL长尾噬菌体（siphovirus）。主要方法包括双层琼脂法增殖与滴定噬菌体、浮游杀灭试验、吸附试验、单步生长试验，以及生长抑制和噬菌体-消毒剂协同试验；通过生长降低系数（growth reduction coefficient, GRC）和既定分类框架判断协同、拮抗、相加或自主。统计用R Studio和GraphPad Prism，P<0.05为显著。

研究结果：
1. O-抗原是SF1吸附和裂解复制所必需。研究人员在S. Enteritidis FSL S5-483中构建四个候选基因dcm、wcaJ、rfaB和rfbC的框内缺失突变体，并检测其与SF1的动态。所有四个突变体在TSB中生长良好，但ΔrfbC呈现生长缺陷，整体生长产量显著低于野生型亲本。SF1在20 h内仅适度降低野生型FSL S5-483及Δdcm、ΔwcaJ、ΔrfaB的生长，GRC约0.45，并通过约6 h延迟细菌出条，但在ΔrfbC中该效应完全消失，GRC降至零。此外，ΔrfbC是唯一吸附率和爆发量均降至零的菌株，其他清洁缺失突变体这些特性未明显改变。因此，O-抗原对SF1在S. Enteritidis FSL-S5-483中的吸附和裂解复制不可或缺，而dcm、wcaJ、rfaB不直接赋予SF1抗性。

2. LPS截短增加对商业消毒剂的敏感性。基于ΔrfbC和ΔrfaB等突变体测试苯扎氯铵（BAC）、过氧化氢（H₂O₂）、三氯生、过氧乙酸、次氯酸钠和乙醇。ΔrfbC对BAC和H₂O₂敏感性增加，对三氯生敏感性降低；后者可能与三氯生为抑菌性脂肪酸合成靶向化合物，对慢生长、脂质需求降低的ΔrfbC效果较低有关。ΔrfaB对BAC和三氯生显著敏感化，但对H₂O₂敏感性未改变。Δdcm和ΔwcaJ未对这些化合物明显敏感化，所有清洁缺失突变体对过氧乙酸、次氯酸钠或乙醇敏感性未改变，提示该导向介导敏感化机制并不同等适用于所有消毒剂。ΔrfaB相对ΔrfbC总体敏感性增加，符合更粗糙LPS突变体通常对抗菌剂更敏感的范式，并提示选择更深LPS截短的噬菌体可能诱导更明显导向相关权衡；同时两种突变体不同敏感谱提示，由LPS核心和O-抗原吸附噬菌体组成的鸡尾酒可增加细菌对更广泛消毒剂的敏感性。

3. SF1与商业消毒剂协同。为确定SF1是否适合作为商业消毒剂佐剂，研究人员在存在和不存在SF1时测试每种消毒剂在多个浓度下的抗菌效果。SF1在几乎所有测试浓度提高六种消毒剂的效果，支持该噬菌体作为佐剂使用。对于SF1选择LPS突变体ΔrfaB和ΔrfbC未敏感化的消毒剂，包括过氧乙酸、次氯酸钠和乙醇，SF1-消毒剂组合的抗菌效果仅为相加，提示两种药剂杀菌作用独立且不相互作用。相反，对于至少一种SF1选择LPS突变体超敏的消毒剂，包括BAC、H₂O₂和三氯生，组合的抗菌效果为数学协同。这些发现与以下假设一致：除直接杀菌活性外，SF1通过选择消毒剂超敏表型增强消毒剂疗效。尽管类似协同机制此前已在噬菌体作为抗生素佐剂的组合中证明，但据研究人员所知，这是首次报道证明噬菌体导向可作为将噬菌体部署为商业消毒剂协同佐剂的策略。

讨论与结论：讨论指出，这些发现并不完全意外，因为LPS O-抗原作为主要受体在Caudoviricetes噬菌体包括感染沙门氏菌的噬菌体中常见；因此本研究总体发现可能代表更广泛的一类将细菌群体导向LPS缺陷表型的噬菌体。LPS结合噬菌体已显示可选择毒力降低且对血清、抗菌肽和抗生素敏感性增加的细菌群体，但导向至商业消毒剂超敏仍相对未被充分探索。先前Lauman et al.研究表明，O-抗原结合Burkholderia噬菌体KS12选择对包括阳离子消毒剂BAC在内的广谱膜作用抗菌剂超敏的存活群体，并将此现象与O-抗原丢失介导的外膜（outer membrane, OM）高通透性直接联系，符合OM作为关键通透屏障的作用。本研究中，对BAC和H₂O₂的敏感化与OM通透性变化一致，但三氯生作用复杂；ΔrfaB对H₂O₂缺乏敏感化的满意机制解释仍未明确。SF1单独仅表现适度抗菌效果，但仍可作为佐剂，支持即使直接杀菌活性欠佳，噬菌体仍可能具有干预用途。组合仅在对相应LPS突变体敏感的消毒剂中表现协同，说明机制与导向选择相关。研究局限在于使用单一噬菌体-宿主系统且为良好混合培养的受控条件。未来应研究类似“导向协同”效应是否发生在多样噬菌体-宿主系统及更代表食品生产加工环境的条件中，包括污染表面和复杂多微生物群落；还应研究这些导向相关权衡的长期稳定性，尤其是对噬菌体和消毒剂均耐受的残余亚群出现的可能性。更广泛地，研究人员的发现凸显利用进化权衡改善食品生产链中细菌病原控制的潜在价值。

研究结论翻译：在本研究中，研究人员确认OL沙门氏菌噬菌体SF1需要完整O-抗原层用于吸附和裂解复制，并证明O-抗原丢失或更深LPS截短增加对若干商业消毒剂的敏感性。重要的是，SF1增强所有受试消毒剂的抗菌活性，并且与SF1选择LPS突变体对其超敏的化合物表现出数学协同。总体而言，这些发现与以下假设一致：SF1不仅作为杀菌剂发挥作用，还作为进化导向工具，通过选择超敏群体增强消毒剂活性。在实践中，噬菌体导向可通过将适当选择的噬菌体与消毒剂一起或先于消毒剂部署而纳入卫生策略，使直接噬菌体介导的杀灭由对存活群体的选择所补充，这些存活群体具有增加的消毒剂敏感性。尽管这些发现是在受控条件下使用单一噬菌体-宿主系统和良好混合培养获得，但它们仍证明噬菌体导向作为将噬菌体部署为商业消毒剂佐剂策略的潜在效用。未来工作应探究类似“导向协同”效应是否发生在多样噬菌体-宿主系统以及更代表食品生产和加工环境的条件中，包括在污染表面和复杂多微生物群落内。此外，这些导向相关权衡的长期稳定性，特别是对噬菌体和消毒剂均耐受的残余亚群可能出现的风险，值得未来研究。更广泛地，研究人员的发现凸显利用进化权衡改善食品生产链中细菌病原控制的潜在价值。