多年生黑麦草与苇状羊茅生长季间叶片木质化及衰老对体外发酵过程和瘤胃微生物群的影响

《Crops》：Lignification and Foliar Senescence of Lolium perenne and Festuca arundinacea Between Growing Seasons Affect Fermentative Processes and Ruminal Microbiota

　　

草叶组织中细胞壁木质化发生于植物发育和衰老过程中，降低瘤胃中可发酵碳水化合物的可利用性。然而，这些季节性效应对细胞衰老、木质素聚集和养分可利用性的影响仍不清楚。因此，本研究的目的是评估多年生黑麦草（Lolium perenne）和苇状羊茅（Festuca arundinacea Schreb.）的叶片衰老和收获季节（2012年冬季 vs. 2013年夏季）对叶片木质素聚集、体外发酵和微生物黏附的影响。试验采用裂-裂区设计；生长季为主区，草种为裂区，衰老阶段（0%、30%和60%）为裂-裂区。两种草的维管束鞘延伸部纤维中均发生木质素积累（p ≤ 0.05），且冬季苇状羊茅较高。衰老阶段显著影响（p ≤ 0.05）化学成分、消化率（640.0–767.8 g kg^?1 DM）和总挥发性脂肪酸（VFA）产量（占总VFA的31.7–43.4%）。此外，瘤胃微生物群发育出用于黏附的胞外结构，与未衰老叶片（0%）相比，当叶片组织显示较高木质素积累时该黏附降低。2012年冬季和2013年夏季的体外干物质降解率、VFA产量、化学成分和含量以及瘤胃微生物黏附均受衰老阶段影响。

研究背景与意义：在草类中，细胞壁木质化发生于植物组织发育和衰老过程。细胞衰老涉及由衰老相关基因（SAGs）调控的生化与结构反应，并受生物和非生物因素诱导。木质部导管分化时，植物细胞壁增厚并死亡，随后发生木质素聚集；在厚壁纤维等组织中，细胞壁随成熟而增厚并被木质素浸染。气候条件通过转录因子和SAGs影响植物细胞衰老、代谢和次生细胞壁木质素聚集。木质素在细胞壁中的空间聚集因基因型、组织、细胞类型、生长、成熟阶段和非生物胁迫而异。既有研究显示，Begovi? et al. 表明木质素积累取决于物种和生长阶段；Festuca arundinacea 次生细胞壁随环境变化和叶龄增加，而 Lolium perenne 的化学成分受气候影响大于基因型。González-Mu?oz et al. 显示 Festulolium 从28至35 d衰老时，体外干物质降解率和96 h总挥发性脂肪酸（VFA）产量分别下降4.68%和28.98%。在瘤胃发酵中，木质素嵌入草组织细胞结构，阻碍瘤胃微生物群对养分的可利用性和降解；降解依赖定殖、微生物黏附及组织表面生物膜形成。细菌不易黏附于木质化维管束鞘及原生木质部和后生木质部导管，妨碍这些结构完全降解。因此，季节性环境条件和温带草叶片衰老阶段可影响细胞结构木质素聚集，进而影响瘤胃养分可利用性。本研究旨在评估 Lolium perenne 和 Festuca arundinacea Schreb. 在2012年冬季与2013年夏季收获时三个叶片衰老阶段对叶片组织木质素聚集、体外瘤胃发酵和微生物黏附的影响。研究结论表明，天气条件影响两种草叶片组织细胞壁木质素聚集，尤其是叶中脉维管束鞘；高级衰老和叶片木质化组织增加影响体外干物质降解、发酵变量和细菌黏附。这对理解温带牧草季节与衰老对瘤胃发酵和微生物附着的影响具有重要意义。

主要关键技术与样本来源：研究在墨西哥 Llano Grande, Jiquipilco 的2010年建植草地开展；海拔2560 m，年降水800–1300 mm，气候为 C (w₂)，平均温度13.2 °C，土壤为 Pronasol 型。样本来源为 Lolium perenne 和 Festuca arundinacea Schreb.，于2012年冬季和2013年夏季测定0%、30%和60%叶片衰老阶段。试验为裂-裂区设计，生长季为主区，草种为裂区，衰老阶段为裂-裂区；每处理3个重复。关键技术包括田间分蘖标记与衰老百分率测量；干物质（DM）、灰分、中性洗涤纤维（NDF）和酸性洗涤纤维（ADF）化学分析；FAA固定、phloroglucinol-HCl染色和显微图像分析木质化面积；体外降解与发酵使用两只带瘤胃瘘管 Holstein 奶牛瘤胃液，G-RF培养基38 °C培养72 h，气相色谱测VFA；扫描电镜观察细菌黏附；PROC MIXED 与 AR(1) 协方差结构统计分析。

研究结果：

3.1 天气条件与衰老：叶片再生至叶舌出现历时30 d，总叶衰老在2012年冬季和2013年夏季分别于60 d和70 d达到最大。2012年冬季温度与降雨降至2013年2月和3月最低值，且2012年12月至2013年2月连续霜冻；2013年夏季最高平均温度21 °C、最低3 °C，6月至9月降雨增加至349 mm。

3.2 叶片组织木质素聚集：组织化学与图像分析显示，Festuca 中央叶脉维管束鞘区域平均木质素积累13.58%，高于 Lolium 的9.59%；总叶面积平均木质素积累在 Festuca 为11.76%，高于 Lolium 的7.52%。2013年夏季，Lolium 和 Festuca 总叶面积木质素积累比2012年冬季多6.78%；中央叶脉维管束鞘区域木质素聚集在两季相似。0%对照木质化横截面积低于30%和60%衰老阶段。冬季木质素主要积累于维管束，尤其木质部导管、维管束鞘内部细胞壁和维管束鞘延伸（EVBS）；EVBS 厚壁纤维随衰老红色增强。2013年夏季维管束鞘几乎不染红。冬季0%衰老时，两草 EVBS 内部细胞呈“U”形切向增厚和木质化；Lolium 后生木质部在三个衰老阶段增大；总体60%衰老时次生细胞壁增厚和木质化增加。Festuca 的 EVBS 相对面积大于 Lolium，且在30%和60%衰老阶段木质化较少。

3.3 化学成分：生长季与衰老阶段互作显著影响 DM、有机质（OM）、NDF 和 ADF。总体而言，30%衰老较0%衰老使 DM 平均增加15.3%，60%衰老较30%衰老使 DM 增加13.7%；0%衰老的 OM 低于30%和60%衰老；0%衰老的结构性碳水化合物低于30%和60%衰老。2012年冬季，30%和60%衰老草比0%分别多积累14.9%和17.7% DM；2013年夏季，0%衰老草 DM 低于30%和60%衰老。冬季30%和60%衰老草 NDF 高于0%；夏季30%和60%衰老草 OM 更高，0%衰老草 NDF 更低。冬季0%衰老草 ADF 中半纤维素和木质素含量低于30%和60%衰老草。

3.4 叶片组织体外发酵：2013年夏季草体外干物质降解率（IVDDM）比2012年冬季高2.8%；冬季30%和60%衰老使 IVDDM 低于0%衰老。夏季0%和30%衰老草 IVDDM 相似，60%衰老草 IVDDM 较高。0%衰老草乙酸比例高于30%和60%衰老草。冬季0%和30%衰老草丙酸浓度高于60%衰老草；夏季0%衰老草丙酸浓度高于30%和60%衰老草。夏季30%衰老草丁酸产量高于0%和60%衰老草；冬季0%衰老草丁酸产量高于60%衰老草。

3.5 瘤胃微生物群对叶片组织黏附：浸解使叶肉、表皮和维管组织碎裂，暴露细胞组分。扫描电镜显示，细菌群通过丝状胞外结构黏附于叶残渣，部分形成具有通道和孔洞的海绵状生物膜；微生物分布和黏附不均匀，聚集于细胞壁。72 h培养时，瘤胃菌群在薄壁组织和非木质化组织（叶肉和表皮细胞）上多于次生木质化细胞壁（导管和纤维）。

讨论部分总结：4.1 衰老和季节对叶片木质素聚集的影响：2012年冬季两草 EVBS 厚壁组织在60%衰老时完全木质化并呈强红色；程序性细胞死亡协调细胞壁合成、木质素聚集和木质部管状元件分化。2013年夏季 Lolium 和 Festuca 后生木质部随细胞衰老增大增多。温带牧草木质部和厚壁组织对 phloroglucinol-HCl 反应强，叶肉和表皮反应可变；跨生长季解释需谨慎，因其仅反映所评估季节表现。与木质部不同，韧皮部除伴生纤维外不随细胞死亡木质化。原文认为夏季衰老对 Festuca 木质化影响大于 Lolium。Buxton 和 Fales 认为夏季 Lolium 因温度和降雨生长、成熟和早花更明显。Moghaddam 和 Wilman 发现 Lolium perenne 叶片组织中薄壁组织、厚壁组织和表皮增厚少于 Festuca arundinacea。EVBS 在0%和30%衰老呈淡粉色，60%呈强粉色；强红色提示 coniferyl aldehyde、sinapyl aldehyde 和 syringyl aldehyde 基团更丰富。Festuca arundinacea Schreb. 茎组织从营养期向生殖期转变时 syringyl 单元增加而 guayacil 含量下降。Moura et al. 指出低温下编码 cinnamate 3-hydroxylase（C3H）的基因表达增加，该酶参与苯丙烷生物合成和木质素。原木质部腔随衰老在两季增大。Macadam 和 Nelson 观察到 Festuca arundinacea 叶片伸长75 mm后后生木质部、维管束鞘和远轴纤维束径向扩张。冬季草总叶面积和中央叶脉维管束鞘木质化横截面积高度相关。刈割年龄60 d影响 NDF 和 ADF，但 ADL 未变化。Lolium perenne 再生和早期刈割叶组织中葡萄糖、木糖和总酚含量有变化；Lolium multiflorum 衰老叶细胞壁、酚含量和降解率亦有报道。原文认为本研究的化学成分可能因冬季少云日少、太阳辐射增加，进而影响光合和生长，NDF、ADF 和 OM 反映生长季、细胞衰老和叶片组织木质素聚集。

4.2 衰老对体外降解和微生物黏附的影响：每个生长季内，Lolium 和 Festuca 的 IVDDM、pH、氧化还原电位（Eh）和 VFA 因叶片衰老增加而存在差异。相似 IVDDM 结果在 Festulolium 28和35 d成熟时被报道，因 ADF 增加而下降。Ohlsson 指出温度从10升至20 °C时，每升高1 °C消化率下降0.7单位。瘤胃 pH 改变会影响微生物代谢，需通过还原和 NAD⁺/NADH 再氧化维持 Eh 平衡，否则 VFA 浓度、解聚速率、底物可利用性和偏好及细菌发酵调节会改变。本研究中乙酸/丙酸比接近1.0，可能因原生动物被排除，通常原生动物排除会增加丙酸摩尔比例而牺牲丁酸。原生动物发酵结构性碳水化合物并贡献约三分之一微生物生物量，排除会降低 OM 和 NDF 降解率。因此，本研究的 DM、OM、NDF 降解和 VFA 产量仅归因于瘤胃接种物中的细菌，外推结果需考虑该因素。关于微生物黏附，较老细胞具有更多次生和木质化细胞壁，尤其管状元件和纤维。研究人员观察到表皮和维管束木质部细胞部分降解，部分结构保持完整，与 Anderson 和 Akin 的观察一致。黏附细菌形态包括球菌、杆菌、葡萄球菌和链球菌。瘤胃球菌和杆菌缓慢黏附于厚壁组织和木质部残渣，可能不存在于 L. perenne 幼叶木质化木质部导管。Festuca 组织碎片中球菌优先黏附于厚壁组织，但未见这些木质化组织降解。Cynodon dactylon L. Pers 叶细胞中37%黏附细菌为革兰阴性杆菌并表达胞外结构，可达瘤胃微生物群的70%。Dactylis glomerata 干草24 h瘤胃 incubation 后 Fibrobacter succinogenes 对叶组织黏附高于茎。switchgrass（Panicum virgatum）72 h瘤胃 incubation 后，瘤胃菌群中 Prevotella spp.、Butyrivibrio spp.、Clostridium spp.、Fibrobacter spp. 和 Ruminococcus spp. 相对丰度较高；小麦秸秆72 h in sacco incubation 后亦观察到类似组成。但扫描电镜和形态学描述需通过测序技术确认瘤胃微生物群相对丰度。本研究中，瘤胃微生物黏附随细胞结构木质化增加而下降；体外降解生物膜在高密度微生物生态系统中成熟。细菌群落协同对细胞壁降解重要，尤其消化晚期。微生物簇和物种差异反映底物偏好决定的发酵模式，进而影响冬夏草 IVDDM 和 VFA 产量。

研究结论翻译：2012年冬季和2013年夏季的天气条件影响 Lolium perenne 和 Festuca arundinacea 叶片组织细胞壁中木质素聚集，特别是衰老期间叶中脉维管束鞘。两种研究草叶片的高级衰老和木质化组织增加影响体外干物质降解、发酵变量和细菌黏附。