《Food Chemistry: Molecular Sciences》：Cloning, expression, tertiary structure, activity characteristics, design of inhibitor, hydrolysis and inhibition mechanisms analysis of carp adipose triglyceride lipase (ATGL)
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鲤鱼脂肪甘油三酯脂肪酶（ATGL）被克隆、表达并纯化。研究人员分析了鲤鱼ATGL的活性特征、三级结构和水解机制。研究人员设计了一种ATGL抑制剂并分析了其抑制机制。该ATGL抑制剂由必需氨基酸组成，是一种营养强化剂，有望作为鲤鱼肉制品中的添加剂。该抑制剂会被A
鲤鱼脂肪甘油三酯脂肪酶（ATGL）被克隆、表达并纯化。研究人员分析了鲤鱼ATGL的活性特征、三级结构和水解机制。研究人员设计了一种ATGL抑制剂并分析了其抑制机制。该ATGL抑制剂由必需氨基酸组成，是一种营养强化剂，有望作为鲤鱼肉制品中的添加剂。该抑制剂会被ATGL的疏水活性凹槽误识别并形成空间位阻（steric hindrance），阻止ATGL与甘油三酯（triacylglycerols）结合。
研究背景与问题：鲤鱼（Cyprinus carpio）是经济重要的淡水鱼，2025年中国养殖产量约300万吨。鲤鱼因肉品质好、营养价值高而受消费者和生产者青睐，但鱼肉在加工或贮藏中更易腐败，原因包括内源酶丰富、肌肉水分高、组织细嫩以及消化道或鳃附着的多种细菌。内源酶引起的脂质分解是鱼类腐败的重要因素之一。脂质分解产生醇、醛、酮等小分子化合物，影响鱼品质；过度脂解还会加速蛋白降解，导致鱼肉或鱼糜凝胶软化。脂质分解包括氧化和水解，并可相互促进。脂质氧化包括自动氧化、光敏氧化和脂氧合酶（lipoxygenases，LOXs）酶促氧化；脂质水解主要由三种胞内酶介导：脂肪甘油三酯脂肪酶（adipose triglyceride lipase，ATGL）、激素敏感脂肪酶（hormone-sensitive lipase，HSL）和单酰甘油脂肪酶（monoglyceride lipase，MGL）。ATGL主要水解三酰甘油，HSL主要水解二酰甘油，MGL主要水解单酰甘油。ATGL起始三酰甘油水解，被认为是脂解级联的限速酶，并在脂肪组织、心脏以及肝、肾、胰、肌肉等组织表达。鱼中研究显示，罗非鱼生长、生化参数和免疫指标与ATGL表达相关；斑马鱼饲料添加Atglistatin后可出现严重脂肪沉积，并伴随氧耗和脂肪酸β-氧化降低、氧化应激和炎症反应加重。肌肉组织中也检测到残余ATGL活性。因此，内源ATGL与鱼肉品质变化密切相关，研究人员有必要克隆鲤鱼ATGL，分析其活性、三级结构和水解机制，并设计抑制剂，为脂质水解酶基础研究和鲤鱼加工品质控制提供依据。
研究开展与结论意义：研究人员克隆并原核表达了鲤鱼ATGL，分析了酶活性特征、预测三级结构和水解机制，设计并研究了ATGL抑制剂的抑制机制。结果表明，鲤鱼ATGL N端域长768 bp，编码256个氨基酸，分子量27.7 kDa，pI 7.98，跨物种相似性约80%；重组ATGL可在E. coli中表达，pH 7活性最高，碱性条件抑制更强，pH从7升至10时活性下降92.1%；温度影响较小，5 °C和50 °C仍分别保留约73.6%和62.8%活性。预测三级结构为单体蛋白，含9个α-螺旋和7个β-链，无二硫键，Rg约1.84 nm；活性中心为催化二联体Ser47-Asp166，位于约1.9 nm×1.7 nm的疏水活性凹槽底部，三个柔性疏水环参与底物结合。三酰甘油嵌入凹槽，酯键接触催化二联体，柔性环构象变化包裹三酰甘油；ATGL与三酰甘油总相互作用能约?85.8 kJ/mol，Phe17、Leu90、Ile148、His204等残基重要。研究人员设计的小肽Lys-Leu-Ile-Met-Val在0.1 mg/mL时使ATGL水解活性降低81.5%，与ATGL总相互作用能为?62.7 kJ/mol，Arg77、Leu258、Val261等残基重要；鲤鱼鱼糜4 °C贮藏5天后，TBARS值和酸值较对照分别降低8.3%和9.9%（P<0.05）。该研究为脂质水解酶基础研究提供参考，也为鲤鱼加工品质控制提供依据。
主要关键技术方法：样本来源于鲤鱼背肌组织，并遵循西昌大学实验动物指南。研究人员提取RNA、反转录并PCR克隆ATGL N端域，测序后构建pET-30a-ATGL-N并转化E. coli BL21(DE3)，诱导表达、Ni-NTA纯化并梯度透析复性。用[9,10-
3H]triolein放射性底物和液闪计数测定酶活；采用SWISS-MODEL同源建模、PyMOL建模、Discovery Studio分子对接；用Amber进行100 ns全原子分子动力学模拟，并以MM-PBSA计算结合自由能。化学合成小肽后用HPLC和MS表征；在鲤鱼鱼糜中加入小肽，4 °C贮藏5天，按GB方法测定TBARS值和酸值。
研究结果：
（一）鲤鱼ATGL的克隆。通过从鲤鱼肌肉组织提取RNA、反转录、PCR扩增和测序，研究人员获得鲤鱼ATGL N端域。该域长768 bp，编码256个氨基酸，分子量27.7 kDa，pI 7.98。序列相似性分析显示，鲤鱼ATGL与其他物种ATGL相似性约80%，其中Larimichthys crocea为87.11%，Homo sapiens为78.13%，Sus scrofa为76.56%，Mus musculus为79.24%，Bos taurus为78.91%，Anser anser为80.47%，Coturnix japonica为80.08%。ATGL跨物种高度保守；作为比较，另一种脂质水解酶HSL在人-鲤间相似性仅约50%。
（二）ATGL的原核表达与活性分析。通过构建pET-30a重组质粒并转化E. coli BL21，诱导后出现约27 kDa强蛋白带，重组蛋白以包涵体形式存在，经镍亲和层析和透析浓缩后SDS-PAGE显示单带，表明重组ATGL成功纯化。活性分析显示，pH 7时活性最高，升高或降低pH均降低活性，碱性抑制强于酸性，pH 3时仍保留约26.4%最大活性。鲜鲤肉pH约7.1，贮藏中最低降至6.7，第10天回升至7.1；鱼糜凝胶在pH 8.0时凝胶强度和持水性最佳。因此，实际中调节pH至微碱性既可保证鱼糜凝胶品质，也可有效抑制ATGL。温度影响小于pH，20—35 °C活性变化小，5 °C和50 °C时分别保留约73.6%和62.8%活性，说明单独低温贮藏不能完全控制鲤鱼肌肉中三酰甘油水解。
（三）ATGL的三级结构。通过100 ns分子动力学模拟，研究人员表征了ATGL三级结构。模型RMSD前10 ns升高后稳定；鲤鱼ATGL为单体蛋白，无二硫键，Rg约1.84 nm，含9个α-螺旋和7个β-链。β-链平行或反平行排列，α-螺旋分布于β-链周围。RMSF显示β-链和α-螺旋较低，环结构柔性较高，三个高柔性区为α4—α5环（Ser87-Arg95）、α7—β5环（Tyr147-Pro156）和β6—α8环（Ser188-Asp197），位于活性中心上方，可能与底物结合相关。活性中心为催化二联体Ser47-Asp166，位于约1.9 nm长、1.7 nm宽的活性凹槽底部。Kyte-Doolittle疏水性分析显示，凹槽底部绝大多数残基疏水，包括Pro14、Trp15、Asn16、Ile17、Asn46、Arg48、Tyr51、Asn142、Glu143、Glu144、Leu145、Thr165、Gln167、Gly168；ATGL表面大多亲水。三个高柔性环中两个完全疏水，一个部分疏水，支持其参与疏水脂链结合。
（四）ATGL的催化机制。通过分子对接和SASA变化分析，研究人员发现ATGL与三酰甘油复合后，Ser47、Leu90、Tyr151、Asp166、Ile193等残基处SASA显著降低，相互作用位点位于活性凹槽和高柔性环。三酰甘油嵌入活性凹槽，其酯键靠近催化二联体，Asp166和Ser47与酯键距离分别为0.374 nm和0.401 nm。模拟中三个柔性疏水环发生构象变化，逐步将三酰甘油包裹在腔内，保证高效水解。MM-PBSA计算显示，ATGL与三酰甘油总相互作用能约?85.8 kJ/mol，范德华力为?118.5 kJ/mol、静电作用为?11.81 kJ/mol、疏水作用为?17 kJ/mol，均有利于复合物形成；亲水作用不利，因三酰甘油强疏水。负总能量表明ATGL与三酰甘油可在水溶液中自发结合。Phe17、Leu90、Ile148、His204等残基对结合重要，可作为抑制剂设计靶点。
（五）ATGL抑制剂设计及抑制机制分析。基于ATGL三级结构和催化机制，研究人员设计小疏水必需氨基酸肽作为竞争性抑制剂。初步实验中，Lys-Leu-Ile-Met-Val抑制效果最好；HPLC和MS显示纯度95.7%，分子量约0.6 kDa，pI 9.70。中性pH下该小肽带正电且溶解性良好，室温最大溶解度约0.7 mg/mL，4 °C约0.4 mg/mL。加入ATGL水解反应体系后，随小肽浓度升高，ATGL活性逐渐受抑，0.1 mg/mL时水解活性降低81.5%。分子对接和动力学模拟显示，小肽因高疏水性和合适尺寸被ATGL疏水活性凹槽误识别，形成空间位阻，阻止三酰甘油结合，从而竞争性抑制ATGL。小肽与ATGL总相互作用能为?62.7 kJ/mol，表明稳定自发结合；Arg77、Leu258、Val261对结合尤其重要。鲤鱼鱼糜中加入小肽并于4 °C贮藏5天后，TBARS值和酸值较对照分别降低8.3%和9.9%（P<0.05），表明小肽可有效控制鱼肉脂质水解和氧化。
讨论部分总结：已有Atglistatin衍生物、G0S2、二甲双胍等对ATGL有显著抑制活性。G0S2由103个氨基酸组成，其缺失N端和C端的33氨基酸肽Lys20-Ala52也强抑制ATGL，且高度疏水；本研究设计的小肽同样高度疏水，提示疏水相互作用在ATGL底物结合中占主导。但二甲双胍、Atglistatin衍生物等更偏药物用途，而非食品添加剂。其他保鲜策略包括用ε-聚赖氨酸、PostbioYDFF-3抑制腐败菌，或用迷迭香提取物、银杏叶提取物等抗氧化。抑制内源ATGL活性控制脂解可从源头防止脂质氧化。本研究小肽全由必需氨基酸组成，兼具ATGL抑制剂和营养强化剂作用，成本较低，有望作为鲤鱼肉制品添加剂。讨论也指出，小肽在鱼糜中是否可能通过疏水作用误结合内源LOX并影响其与疏水脂肪酸底物结合，尚待验证；其在真实鱼加工中的应用模式也需探索。
研究结论翻译：本研究中，研究人员从鲤鱼肌肉组织克隆了ATGL N端域。其长768 bp，编码256个氨基酸，pI 7.98，分子量27.7 kDa。N端域跨物种高度保守，相似性可达约80%。重组ATGL在E. coli中成功表达，并表征了不同温度和pH下的活性。pH变化对活性影响更大，尤其碱性条件：pH从7升至10时，活性下降92.1%，提示实际中调pH至碱性可有效抑制ATGL。温度影响较小；即使5 °C或50 °C，ATGL仍分别保留约73.6%和62.8%活性，表明单独低温贮藏不能完全控制三酰甘油水解。预测的三级结构为单体蛋白，含9个α-螺旋和7个β-链，无二硫键，Rg为1.84 nm。活性中心为催化二联体Ser47-Asp166，位于约1.9 nm×1.7 nm、主要疏水的活性凹槽底部。凹槽周围三个柔性疏水环密切参与疏水脂链结合。水解机制为：三酰甘油分子嵌入活性凹槽，其酯键接触催化二联体；三个柔性环发生构象变化并包裹三酰甘油，促进水解。ATGL与三酰甘油总相互作用能约?85.8 kJ/mol。Phe17、Leu90、Ile148、His204等残基对该相互作用重要，可作为抑制剂设计靶点。研究人员最后设计了ATGL抑制剂：由疏水必需氨基酸组成的小肽Lys-Leu-Ile-Met-Val。0.1 mg/mL时，该肽使ATGL水解活性降低81.5%。由于其高疏水性和合适尺寸，小肽被ATGL疏水活性凹槽误识别，形成空间位阻，阻止三酰甘油结合，竞争性抑制该酶。小肽与ATGL相互作用能为?62.7 kJ/mol，表明稳定自发结合。除强抑制效果外，该必需氨基酸衍生肽可作为营养强化剂且成本低，有望成为鲤鱼肉制品添加剂。加入小肽后，鲤鱼鱼糜贮藏期间脂质水解和氧化得到有效控制。此外，本研究ATGL三级结构及其与三酰甘油相互作用的分子细节主要基于分子动力学模拟，模拟环境可能与实际条件存在差异，尚需进一步实验验证。未来可用等温滴定量热法（isothermal titration calorimetry，ITC）、表面等离子体共振（surface plasmon resonance，SPR）、小角X射线散射（small-angle X-ray scattering，SAXS）进一步表征ATGL结构特征；有限蛋白酶解结合质谱和定点突变可用于研究Ser44-Asp166及柔性环区是否为ATGL底物结合关键位点。该研究为脂质水解酶基础研究提供重要参考，并为控制鲤鱼加工品质提供依据。
