《Current Opinion in Structural Biology》：Resolving single-amyloid polymorphism in neurodegeneration via micro-to-nano analytical imaging and spectroscopy
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到2050年，全球将有十亿人受到与功能性蛋白质淀粉样蛋白（amyloid）异常相关的人类疾病影响，例如神经退行性疾病（neurodegeneration）。然而，淀粉样蛋白与疾病之间的关系尚不明确；因此目前尚无有效的治疗手段或治愈方法。这一认知空白在很大程度上
到2050年，全球将有十亿人受到与功能性蛋白质淀粉样蛋白（amyloid）异常相关的人类疾病影响，例如神经退行性疾病（neurodegeneration）。然而，淀粉样蛋白与疾病之间的关系尚不明确；因此目前尚无有效的治疗手段或治愈方法。这一认知空白在很大程度上源于技术限制，无法表征异质性且纳米尺度的淀粉样蛋白，也无法揭示其多态性特性如何对细胞毒性至关重要。本综述回顾了纳米成像和纳米化学光谱学在从单分子水平到细胞和组织分析中揭示淀粉样蛋白多态性的最新进展。研究人员引入了淀粉样蛋白化学多态性（chemical polymorphism）的概念，超越了经典的在形态学层面的毒株（strains）和多态性，将其作为连接淀粉样蛋白特性与毒性的关键特征。
研究背景与现存问题
超过50种人类疾病与蛋白质错误折叠导致的异常聚集过程有关，这些聚集体被称为淀粉样蛋白（amyloid）。到2050年，淀粉样蛋白相关疾病将影响全球十亿人口，其中包括帕金森病（Parkinson's disease, PD）、阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）、亨廷顿病（Huntington's disease, HD）和肌萎缩侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis, ALS）等神经退行性疾病。尽管这些疾病造成了巨大的社会经济负担，但淀粉样蛋白与疾病发生及进展之间的分子联系仍不清楚，因此目前尚无有效的疾病修饰疗法或治愈方法。在分子层面，神经退行性疾病与特定蛋白质和肽的功能异常的化学-结构状态相关，其中固体样的凝聚态和中间可溶性寡聚体、原纤维前体导致不溶性成熟淀粉样纤维的形成。这些淀粉样物种具有高度异质性、纳米级尺寸和交叉β折叠（cross-β sheet）的分子特征，通常与点突变和翻译后修饰（posttranslational modifications, PTMs）如磷酸化相关。尽管在理解淀粉样蛋白在神经退行性疾病中的作用方面取得了进展，但最易引起细胞毒性的淀粉样物种的性质及其促进疾病发生和进展的分子机制仍不清楚。这一知识空白主要源于现有技术在表征异质性纳米尺度蛋白质自组装方面的局限性。传统的批量分析方法无法揭示淀粉样蛋白功能、结构与化学性质之间的关联，因为即使是最灵敏的生物化学和分离检测方法也无法从复杂混合物中完全分离出纯化的多态性物种和毒株。
研究内容与意义
本综述聚焦于纳米分析方法的最新应用，旨在揭示疾病中多态性淀粉样物种的异质性构象，超越传统成像在形态学和化学轮廓分辨能力上的局限。研究人员讨论了纳米成像在揭示形态异质性方面的最新进展，以及微米至纳米尺度的化学成像和光谱学在体外和离体条件下表征和关联寡聚体与纤维的三维形态、毒株及其化学特征、内部结构构象、与其他生物分子和代谢物的共定位以及翻译后状态的能力。这项研究的意义在于引入“化学多态性”（chemical polymorphism）这一概念，将其作为连接淀粉样蛋白特性与毒性的关键特征，为理解、诊断和靶向神经退行性疾病提供了新的视角。
关键技术方法
本综述涵盖的主要关键技术方法包括：单分子荧光（single-molecule fluorescence, SMF）成像、冷冻电子显微镜（cryo-electron microscopy, cryo-EM）及冷冻电子断层扫描（cryo-electron tomography, cryo-ET）、原子力显微镜（atomic force microscopy, AFM）、亚微米光热红外光谱（optical photothermal infrared spectroscopy, OPTIR）以及基于原子力显微镜的红外光谱（atomic force microscopy-based infrared spectroscopy, AFM-IR）。
研究结果
纳米成像揭示淀粉样蛋白多态性与毒株
单分子荧光成像研究表明，淀粉样蛋白形成是一个固有的异质性过程，不同大小和形状的寡聚体具有不同程度的细胞毒性。离体研究显示，tau聚集体在AD与其他神经退行性疾病中的丰度、形状和翻译后状态存在差异，表明小的tau聚集体编码了疾病特异性的分子特征，可作为疾病生物标志物。冷冻电镜以埃级分辨率揭示了同一蛋白质在体外和患者来源材料中可呈现多种纤维毒株，并且已在Aβ、tau、α-突触核蛋白和TDP-43中鉴定出疾病特异性毒株，将纤维多态性和分子架构与疾病表型联系起来。结合低温荧光、cryo-ET和cryo-EM的方法实现了对AD死后脑组织中Aβ和tau病理的原位结构解析。原子力显微镜作为单分子技术，能够分析较小的可溶性寡聚体和原纤维前体以及较大的成熟纤维，揭示了淀粉样蛋白的异质性和形态结构多态性。AFM与SMF的结合证明了不同大小和形状的Aβ42寡聚体对脂双层破坏和炎症反应的程度不同。高分辨率AFM研究进一步发现AD脑组织中的可溶性聚集体不仅呈球形，还存在环状构象。
微米至纳米光谱分析揭示淀粉样蛋白化学多态性
红外纳米光谱学的发展使得能够在组织、细胞到单个聚集体等不同尺度上直接表征淀粉样蛋白的分子化学性质。OPTIR技术无需标记即可在组织和细胞中研究淀粉样蛋白，已在AD患者脑组织中揭示了Aβ斑块的二级和四级分子结构异质性以及磷脂含量差异，并证明血管聚集体中的β折叠信号随疾病阶段增加。在单细胞层面，OPTIR结合其他技术证明了淀粉样蛋白与铁簇和氧化脂质的共定位，以及α-突触核蛋白/tau相互作用驱动疾病特异性多态性。AFM-IR技术将AFM的高空间分辨率与IR光谱的化学分析能力相结合，实现了对单个淀粉样物种形貌和化学性质的同时多模态三维成像。AFM-IR研究揭示了形态相似的Aβ和tau纤维可能表现出截然不同的分子二级和四级结构，表明其β折叠组织和分子间堆积存在显著的化学多态性。监测淀粉样蛋白形成的动力学表明，纤维的化学多态性可能随时间变化。
化学多态性的前沿：突变、翻译后修饰与生物分子相互作用
AFM-IR研究已开始探索内在因素（点突变、重复扩增）和外在化学变异（PTMs、分子相互作用）对淀粉样蛋白多态性的影响。对荷兰突变型Aβ40的研究显示了其抗平行到平行交叉β折叠的成熟过程。对亨廷顿蛋白外显子1形成的淀粉样蛋白的研究证明了交叉β折叠结构的含量和顺序与其多聚谷氨酰胺长度直接相关。对tau寡聚体的研究证明了过度磷酸化会导致更小、更硬且更具粘附性的寡聚体形成。此外，AFM-IR研究还表明脂质环境和核酸可以改变纤维的分子二级结构和β折叠组织，从而影响毒性机制。
总结与讨论
本综述强调了互补的纳米分析成像和光谱学的发展和整合正在迅速转变研究人员揭示淀粉样蛋白异质性的能力，超越了形态学和原子层面的分析，引入了从体外到离体再到组织的微米至纳米尺度化学多态性概念。未来在这些方法的整合、数据共享、计算分析和人工智能（无）监督分析方面的发展，将为更深入地理解神经退行性疾病的分子基础铺平道路，同时也有助于定义准确的生物标志物并为针对这些疾病的结构基础疗法提供信息。
