2,4-DTBP 神经毒性的整合网络毒理学、机器学习与多组学表征

《Chemico-Biological Interactions》：Integrated network toxicology, machine learning, and multi-omics characterization of 2,4-DTBP neurotoxicity

　　

摘要
2,4-二叔丁基苯酚（2,4-DTBP）是一种新兴的烷基酚类抗氧化剂，存在潜在的神经毒性担忧，但其分子毒理学基础尚不清楚。在这里，我们应用了一个整合框架，结合了网络毒理学、机器学习辅助靶点优先级排序、分子对接、细胞验证以及整合转录组 - 代谢组学分析，以阐明 2,4-DTBP 诱导的神经毒机制。网络毒理学研究表明，PI3K/AKT、MAPK、钙信号、细胞因子 - 细胞因子受体相互作用以及 ATP 结合盒（ABC）转运体通路是主要的 2,4-DTBP 相关轴。通过整合三种机器学习算法，包括最小绝对收缩和选择算子（LASSO）回归、支持向量机 - 递归特征消除（SVM-RFE）和随机森林（RF），我们收敛地确定了六个可能与 2,4-DTBP 相关神经毒性有关的候选基因：受体酪氨酸激酶 2（ERBB2）、集落刺激因子 1 受体（CSF1R）、RET 原癌基因（RET）、C-C 基序趋化因子配体 22（CCL22）、ATP 结合盒亚家族 C 成员 5（ABCC5）和 ATP 结合盒亚家族 C 成员 1（ABCC1）。SHapley 加性解释（SHAP）量化了它们的贡献并提高了模型的可解释性，而分子对接则为 2,4-DTBP 与其相应靶蛋白之间潜在相互作用提供了初步的结构见解。在 SH-SY5Y 细胞中，100 μM 2,4-DTBP 暴露引发了显著的细胞毒性，其特征为氧化应激、线粒体改变、脂质过氧化、细胞内铁积累、凋亡、铁死亡相关紊乱以及显著的炎症反应。Western blot 进一步证实了 AKT、ERK、NF-κB p65 和 CaMKII 磷酸化水平的改变。铁死亡抑制剂 1（Ferrostatin-1）减轻了 2,4-DTBP 诱导的细胞活力降低、氧化应激、线粒体功能障碍、脂质过氧化、Fe2+ 积累和细胞死亡，并部分恢复了 GPX4、SLC7A11、GCH1 和 ACSL4 的转录变化。多组学整合进一步揭示了炎症程序、突触相关通路、氨基酸和能量代谢以及氧化还原稳态的协同破坏。总之，这些结果支持了一种多层次机制框架，用于理解 2,4-DTBP 诱导的神经毒性，并确定了评估新兴酚类污染物环境神经毒性风险的候选分子靶点和潜在生物标志物。

引言
2,4-二叔丁基苯酚（2,4-DTBP）是一种重要的合成酚类抗氧化剂，广泛用于塑料、橡胶、聚合物稳定剂和其他工业材料中，以增强热稳定性和抗氧化性能 [1], [2], [3]。在结构上，2,4-DTBP 由一个在 2 位和 4 位带有叔丁基取代基的酚类骨架组成，这种取代模式增加了羟基周围的亲脂性和空间屏蔽，从而增强了化学和热稳定性。这些理化性质促成了 2,4-DTBP 的工业用途，但也可能促进其环境持久性和生物摄取。与烷基取代酚类抗氧化剂广泛的工业使用一致，这些化合物已在多种环境基质中被检测到，包括室内灰尘、废水、河流和沉积物，表明其排放来源多样、抗微生物降解以及持续的工业释放 [4], [5]。在相关环境暴露后，也在亚洲蛤蜊的鳃和消化腺中观察到 2,4-DTBP 的积累 [6]。然而，生物体内部的生物积累应与生物放大作用区分开来，后者是指化学物质浓度在连续营养级中的逐步增加。支持 2,4-DTBP 营养级生物放大作用的直接证据仍然有限，其通过水生食物网转移的潜力值得进一步调查。

酚类化合物可通过氧化还原化学、膜扰动和通路水平信号调节发挥生物活性。酚羟基能够进行电子转移反应，可能放大活性氧（ROS）的形成，特别是在有利于氧化还原循环的条件下。当 ROS 产生超过细胞抗氧化能力时，产生的氧化应激会促进脂质过氧化并损害蛋白质、膜脂质和核酸，最终破坏细胞活力和功能 [7], [8]。来自结构相关的烷基酚类抗氧化剂（例如二叔丁基羟基甲苯）的证据进一步表明，这类化学物质可在体外和体内系统中引发内分泌干扰、脂质处理失调和氧化应激表型，可能是通过干扰激素生物合成/信号传导和代谢调节回路 [9], [10], [11]。这些观察结果为调查 2,4-DTBP 的亲脂性和氧化还原活性特性是否有助于细胞损伤提供了毒理学依据。

来自多种生物模型的证据表明，2,4-DTBP 具有广泛的毒理学效应。在水生生物中，相关环境暴露已被发现与组织积累伴随的氧化损伤和炎症激活有关。在亚洲蛤蜊中，相关环境浓度下的暴露与氧化应激和炎症反应有关 [6]。在斑马鱼中，慢性低剂量暴露重塑了肠道微生物群组成和肠道结构，损害了屏障完整性，并改变了控制消化、营养摄取和能量代谢的转录程序 [3]。其他报告将 2,4-DTBP 与繁殖表现受损、性激素信号传导中断和后代发育异常联系起来，支持了其可能作为一种环境内分泌干扰物的担忧 [12]。除了水生模型之外，2,4-DTBP 通过激活过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（PPARγ）- 维甲酸 X 受体（RXR）异二聚体，促进了人间充质干细胞的成脂分化，涉及核受体信号传导和代谢调节的扰动 [13]。

尽管之前的研究将烷基酚和工业抗氧化剂与神经行为和发展毒性联系起来，但 2,4-DTBP 相关神经毒性的分子机制仍不完全清楚。特别是，现有证据尚未被系统地整合以优先确定候选基因或阐明其相关信号通路和调节网络。为了解决这些差距，我们建立了一个整合框架，结合网络毒理学、差异表达分析、多种机器学习算法、分子对接、细胞测定以及转录组 - 代谢组学分析。该框架被用于筛选和优先确定在互补分析方法中一致识别的候选基因，表征其功能相互作用和通路背景，并确定预测的分子改变是否与 2,4-DTBP 诱导的细胞和多组学反应一致。总之，这些发现推进了 2,4-DTBP 相关神经毒性的分子表征，并可能支持新兴酚类污染物的环境危害表征/优先级排序。

章节片段
化学试剂和药物
2,4-DTBP（产品编号：B253388）购自源叶生物科技（上海，中国）有限公司。膜联蛋白 V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶（Annexin V-FITC/PI）凋亡检测试剂盒（产品编号：CA1020）、RNAeasy? 动物 RNA 提取试剂盒（产品编号：R0027）、BeyoRT? III cDNA 合成预混液（产品编号：D7178）和 BeyoFast? SYBR Green qPCR 预混液（产品编号：D7260）购自碧云天生物科技（上海，中国）有限公司。细胞计数试剂盒 8（CCK-8；产品编号：CA1210）由...供应。

2,4-DTBP 相关神经毒性的网络毒理学分析
GSE104687 数据集，包含 27 名神经健康对照和 24 名创伤性脑损伤（TBI）患者，被分析以识别与人类神经损伤相关的转录改变。该数据集被用作神经损伤参考，不被认为代表 2,4-DTBP 暴露的直接转录反应。差异表达分析产生了 307 个差异表达基因（DEGs），包括 159 个上调和 148 个下调 DEGs，通过火山图（图 1A）可视化。层次聚类

讨论
在本研究中，2,4-DTBP 暴露在 SH-SY5Y 细胞中诱导了浓度依赖性细胞毒性，伴随氧化应激、线粒体功能障碍、凋亡、脂质过氧化、细胞内 Fe2+ 积累、炎症激活以及细胞连接相关基因的失调。转录组和代谢组分析进一步揭示了炎症信号传导、神经元和突触通路、氨基酸代谢以及氧化还原稳态的协同改变。通过

结论
本研究建立了一个整合系统级工作流程，结合网络毒理学、多组学分析和机器学习，以阐明 2,4-DTBP 暴露的神经毒后果。优先确定了六个候选损伤相关基因，加强了暴露特征与神经毒表型之间的机制联系。整合基于与 2,4-DTBP 神经毒性相关的优先候选基因进行神经损伤分类分析与 miRNA-TF-mRNA。

局限性
尽管本研究整合了多组学分析与基于细胞的实验，为 2,4-DTBP 相关神经毒性提供了机制见解，但在解释结果时应考虑几点。首先，GSE104687 被纳入作为补充的人类神经损伤参考数据集，以增强候选基因筛选的生物学相关性。该数据集代表 TBI 而非直接的化学暴露；然而，TBI 和毒素诱导的

CRediT 作者贡献声明
Jinchao Zhu：写作 - 初稿，方法论，调查，数据整理，构思。Wenjing Li：写作 - 初稿，调查，数据整理，构思。Jianxin Li：写作 - 初稿，方法论，调查，数据整理，构思。Yue Shi：调查，数据整理。Yanqing Liu：调查，形式分析。Jinrui Dong：写作 - 审阅与编辑，监督，项目管理，经费获取。Nayab Ibrahim：

伦理声明
已获取所有参与者或其法定代理人参加本研究并发表文章的书面知情同意。已尊重参与者的隐私权。
本研究是在研究开展所在地的相关法律、监管框架和指南下进行的。
根据相关法律和机构指南，不需要伦理委员会批准。本研究使用已建系的人 SH-SY5Y 细胞系进行。由于没有

数据可用性
作者声明，支持本研究结果的所有数据均在论文及其补充数据中可用。支持本研究结果的数据已存入中国国家基因库，登录号为 CNP0010115。

利益冲突声明
作者声明，他们没有已知的竞争经济利益或个人关系，这些关系可能看似影响本文报告的工作。

稿件制备过程中生成式 AI 和 AI 辅助技术的声明
本文本的可图形摘要使用 BioRender 制作。

资金来源
本工作得到国家重点研发计划（拨款 2024YFC3016600）；应急管理部医疗救援关键技术与装备重点实验室（拨款 YJBZZJJTJU202403）；以及中国天津市自然科学基金（拨款 23JCYBJC01560）的支持。

利益冲突声明
? 作者声明，他们没有已知的竞争经济利益或个人关系，这些关系可能看似影响本文报告的工作。

Jinchao Zhu|Jianxin Li|Wenjing Li|Yanqing Liu|Yue Shi|Nayab Ibrahim|Jinrui Dong|Haojun Fan
应急管理部医疗救援关键技术与装备重点实验室，天津大学灾害医学与应急学院