《Aging Brain》：Spatial patterns of Wnt/β-catenin signaling in the adult and aging
Nothobranchius furzeri brain
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年龄相关的神经退行性疾病日益成为健康问题，然而驱动神经衰退的分子机制仍知之甚少。经典Wnt/β-catenin信号通路调控神经发育和成体脑稳态的关键方面，其失调与衰老有关。然而，其在衰老大脑中的空间和时间调控尚未完全阐明。非洲绿松石鳉鱼（Nothobranch
年龄相关的神经退行性疾病日益成为健康问题，然而驱动神经衰退的分子机制仍知之甚少。经典Wnt/β-catenin信号通路调控神经发育和成体脑稳态的关键方面，其失调与衰老有关。然而，其在衰老大脑中的空间和时间调控尚未完全阐明。非洲绿松石鳉鱼（Nothobranchius furzeri）寿命短且具有保守的衰老特征，为研究脑衰老提供了有价值的模型。以N. furzeri为模型，研究人员生成了两个新的Wnt信号转基因报告品系以追踪Wnt信号：Tg(Sp5a:eGFP)和Tg(7xTCF:mCherry)。研究人员表征了它们在整个成体大脑不同区域的表达模式，以及若干Wnt相关靶基因的内源性表达。研究人员发现，这两个报告基因在大脑大部分区域存在重叠表达，但在缰核和后屈束尤其存在差异表达。此外，研究人员检测了这种Wnt活性模式在整个衰老过程中在全脑和分离脑区中的变化。研究人员发现全脑水平无显著变化；然而，在后屈束中观察到明显的、性别特异性的结构变化，并且在中脑中Wnt靶基因转录本axin2和sp5发生改变。总之，这些结果证明了衰老N. furzeri大脑中Wnt信号存在区域和性别特异性的调控。
1. 研究背景与科学问题
衰老是神经退行性疾病的主要风险因素，但其背后的分子机制尚不清晰。Wnt/β-catenin信号通路在脊椎动物神经发育和成体脑功能维持中扮演关键角色，包括调控前后轴形成、中脑-后脑边界确立、神经元分化、神经前体细胞增殖、突触完整性和可塑性等。已有研究表明，在衰老和神经系统疾病中，Wnt/β-catenin信号可能发生失调，例如衰老大脑倾向于呈现“Wnt关闭”状态，表现为Wnt配体和靶基因表达降低，而Wnt拮抗剂如Dkk1和GSK3β表达升高。然而，对于Wnt信号在衰老大脑中的时空动态变化，尤其是区域和性别特异性调控，仍然缺乏系统性认识。
非洲绿松石鳉鱼（Nothobranchius furzeri）因其快速发育和极短的天然寿命，已成为研究衰老的有力脊椎动物模型。其大脑展现出多种保守的衰老表型，如线粒体功能障碍、神经发生减少、细胞衰老标志物增加以及DNA甲基化模式改变。尽管Wnt信号在衰老中至关重要，且N. furzeri作为脑衰老模型的应用日益广泛，但鲜有研究考察该通路在鳉鱼大脑中的表达模式，更无研究描绘Wnt信号在整个N. furzeri大脑中的空间分布及其随龄变化。因此，本研究旨在填补这一空白，鉴定成体大脑中活跃Wnt信号的区域，探究这些区域是否与神经发生或神经退行位点相关，并明确这些区域是否随年龄增长而发生改变。
2. 研究方法概述
为实现上述目标，研究人员采用了以下关键技术：
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转基因报告品系构建：利用Tol2转座子系统，构建了两个独立的Wnt/β-catenin信号转基因报告品系：Tg(Sp5a:eGFP)（利用斑马鱼sp5a基因上游1.1 kb调控序列驱动eGFP表达）和Tg(7xTCF:mCherry)（利用7个多聚化的LEF/TCF结合位点和爪蟾siamois最小启动子驱动胞质mCherry表达）。通过显微注射和种系筛选获得稳定转基因品系。
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组织透明化与荧光成像：采用EZ-clear组织透明化技术处理成体杂合子大脑，结合共聚焦和荧光显微镜进行全脑荧光成像与分析。
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原位杂交（ISH）：在成体脑切片上进行RNA原位杂交，检测报告基因（eGFP, mCherry）和内源性Wnt靶基因（axin2, sp5）的mRNA表达模式。
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实时定量PCR（RT-qPCR）：对全脑及四个解剖分区（端脑、丘脑、间脑和中脑、小脑和菱脑）的RNA进行RT-qPCR，定量分析Wnt靶基因（axin2, sp5）、酪氨酸羟化酶（th）及报告基因的表达水平。样本来源于多个年龄组（6、10、15、20、25周龄）的雄性和雌性N. furzeri。
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免疫组织化学：使用抗Gfap（胶质纤维酸性蛋白）和抗TH抗体进行全脑免疫染色，并结合组织透明化技术进行三维成像。
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图像分析与统计：利用ImageJ软件进行荧光强度定量，使用AnalyzeSkeleton插件分析后屈束（FR）的分支结构。采用Student’s t检验、Mann-Whitney U检验或单因素方差分析（ANOVA）及Tukey事后比较进行统计学检验。
3. 研究结果
3.1. 转基因Wnt/β-catenin报告品系在成体大脑中的全脑表达
研究人员成功建立两个稳定的转基因报告品系。通过全脑成像发现，两个报告基因在大脑大部分区域存在广泛的重叠表达，如在下丘脑、松果体以及散布于全脑的未鉴定细胞中。然而，也存在显著差异：Tg(Sp5a:eGFP)在腹侧缰核和后屈束（FR）显示独特的强荧光，而Tg(7xTCF:mCherry)则在此区域不明显；相反，Tg(7xTCF:mCherry)在视顶盖的室周灰质层（PGZ）呈现独特的点状“闪烁样”表达，且不与Gfap共定位。ISH结果显示，报告基因转录本与内源性Wnt靶基因（axin2, sp5）在多个脑区存在重叠，进一步验证了Wnt活性区域。
3.2. 成体硬骨鱼脑中保守的Wnt信号表达模式
通过与先前报道的斑马鱼Tg(7xTCF:nls-mCherry)品系进行比较，研究人员发现两种硬骨鱼在Wnt信号表达模式上具有高度保守性。在斑马鱼中，同样观察到报告基因在血管、下丘脑、端脑、视顶盖、纵走隆凸、侧叶和小脑瓣等结构的广泛表达，这与N. furzeri的ISH结果吻合。两种鱼的视顶盖PGZ层中报告基因表达深度略有差异，可能反映了物种间的神经解剖学差异。
3.3. 衰老过程中全脑Wnt信号保持稳定
通过RT-qPCR检测五个年龄组（6至25周）全脑中Wnt靶基因（sp5, axin2）和th的表达，发现虽然th表达随龄下降（雄性从6到10周显著下降，雌性在25周后才显著下降），但sp5和axin2的表达在所有年龄组和两性中均保持稳定。同时，对Tg(7xTCF:mCherry)和Tg(Sp5a:eGFP)品系的全脑荧光强度进行定量分析，也未发现显著的年龄相关性变化。
3.4. Wnt/β-catenin信号的区域特异性动态变化
鉴于全脑分析未发现变化，研究人员将大脑分为四个区域（端脑、丘脑、间脑和中脑、小脑和菱脑）进行分析。结果揭示了区域、性别和年龄依赖性的Wnt信号变化：
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端脑：老年雌性中axin2表达升高，但mCherry报告基因转录本降低。
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丘脑：雌性th表达在15至25周间下降，但Wnt靶基因无显著变化；雄性th表达反而上升。
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间脑和中脑：axin2和sp5表达随龄下降。
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小脑和菱脑：所有检测靶标均无显著变化。
3.5. 衰老过程中后屈束的结构变化
基于间脑和中脑区域Wnt靶基因的变化，研究人员重点分析了Tg(Sp5a:eGFP)品系标记的后屈束（FR）。结果发现，从15周到25周，雌性N. furzeri的左侧FR出现了显著的年龄相关性结构改变，表现为轴突分支数量和平均分支长度增加，而右侧FR的总面积增大。这些结构性变化仅出现在雌性中，雄性未见平行改变。尽管FR结构紊乱，但FR邻近区域的TH阳性细胞数量和总TH荧光强度并未发生年龄相关性变化。
4. 讨论与结论
本研究首次系统绘制了Wnt/β-catenin信号在成体N. furzeri大脑中的空间图谱，并揭示了其在衰老过程中的动态变化。研究发现，两个互补的转基因报告品系（Tg(Sp5a:eGFP)和Tg(7xTCF:mCherry)）在反映Wnt活性上既有重叠又有差异，这归因于各自调控元件的不同逻辑。Tg(7xTCF:mCherry)提供了一个更简洁的LEF/TCF活性读数，而Tg(Sp5a:eGFP)则反映了更接近内源sp5基因的复杂调控环境，尤其适用于标记缰核-脚间束通路。
在衰老研究中，一个出乎意料的发现是，尽管TH（多巴胺能神经元标志物）表达下降，但全脑水平的Wnt信号整体保持稳定。这表明Wnt/β-catenin信号在衰老过程中并非被广泛下调，而是受到精细的区域性调控。通过分区分析，研究人员确实在端脑和间脑/中脑区域检测到了Wnt靶基因的局部下降，这解释了为何全脑分析会掩盖区域特异性变化。
最引人注目的发现是雌性N. furzeri后屈束（FR）随龄出现的左-右不对称性结构重塑。FR是连接缰核与中脑单胺能核团的关键轴突束，其结构变化可能影响动机、奖赏和运动等功能。该现象与Wnt靶基因Tcf7l2在发育中调控FR不对称性的已知作用相呼应，提示Wnt信号可能在衰老相关的FR重塑中发挥作用。研究认为，FR可能是衰老过程中的一个脆弱结构，其变化类似于“逆行性轴突变性”或代偿性“神经芽生”。这项工作不仅为N. furzeri脑研究建立了重要框架，也为未来探索Wnt信号在脑衰老和神经退行性疾病中的作用奠定了基础。
研究结论翻译：总之，这些结果表明，在衰老的N. furzeri大脑中，Wnt信号存在区域和性别特异性的调控。
