《Frontiers in Oncology》：Integrated genome-wide DNA methylation and transcriptomic analysis prioritizes EPHA5 as a candidate non-invasive epigenetic biomarker for oral squamous cell carcinoma
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目的：口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）因诊断延迟及缺乏经验证的非侵入性生物标志物而仍是重大临床挑战。口腔癌变过程中的表观遗传学改变是颇具前景的生物标志物候选。本研究旨在通过整合全基因组DNA甲基化与转录组学方
目的：口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）因诊断延迟及缺乏经验证的非侵入性生物标志物而仍是重大临床挑战。口腔癌变过程中的表观遗传学改变是颇具前景的生物标志物候选。本研究旨在通过整合全基因组DNA甲基化与转录组学方法，优先筛选具有临床相关性的表观遗传学生物标志物，并对EPHA5进行验证。
实验设计：研究人员进行了全基因组DNA甲基化及转录组学分析，以鉴定OSCC中表观遗传学失调的基因。通过整合DNA甲基化、转录组学数据及生物学相关性对候选基因进行优先排序。随后选取EPHA5进行验证，并在包含OSCC患者、口腔癌前病变（oral premalignant lesions，OPML）及健康对照的独立队列的组织、唾液及血清样本中，采用定量甲基化特异性PCR（quantitative methylation-specific PCR，QMSP）及定量实时PCR（quantitative real-time PCR，QRT-PCR）进行评估。
结果：全基因组分析鉴定出661个上调基因和577个下调基因，以及对应1,776个基因的2,431个差异甲基化区域。整合分析生成了51个候选基因的组合，其中EPHA5通过整合DNA甲基化、基因表达、通路富集及生物学相关性被优先筛选。EPHA5启动子高甲基化在66.7%的OSCC肿瘤中被检测到，而28.6%的肿瘤中观察到启动子高甲基化伴随表达降低。在54.5%的OPML病变及47.6%的OSCC患者唾液中亦检测到甲基化，但在健康对照中罕见。肿瘤EPHA5甲基化可显著区分OSCC与健康对照（AUC = 0.780，p = 0.004；灵敏度，71.4%；特异度，75%）。唾液EPHA5甲基化亦可显著区分OSCC与健康对照（AUC = 0.717，p = 0.025；灵敏度，52.4%；特异度，87.5%），而血清甲基化未显示显著的诊断价值（AUC = 0.571，p = 0.462）。OSCC与OPML之间的区分能力有限，且未达到统计学显著性（肿瘤AUC = 0.662，p = 0.068；唾液AUC = 0.600，p = 0.264）。
结论：频繁的肿瘤高甲基化以及可检测的唾液甲基化支持进一步评估EPHA5作为OSCC候选非侵入性表观遗传学生物标志物。然而，其中等诊断性能、对OSCC与OPML的有限区分能力以及缺乏外部验证表明，在临床实施之前，需要进行更大规模的前瞻性研究以及在多标志物甲基化组合中的评估。
一、研究背景与问题
口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是全球最常见的恶性肿瘤之一，在全球癌症发病率中排名第六。该疾病主要影响50岁以上人群，男性居多，最常发生于舌、唇及口底。OSCC的发生常以口腔癌前病变（oral premalignant lesions，OPML）的恶性转化为先导，包括口腔白斑、口腔扁平苔藓、糜烂型口腔扁平苔藓及口腔苔藓样异型增生。尽管这些病变均具有恶性转化潜能，但其临床病理特征及相关风险各不相同。尽管诊断和治疗不断进步，OSCC仍是全球重大健康负担，早期疾病的5年生存率为70%至90%，而晚期患者则降至30%至50%。
虽然OSCC本质上由遗传改变驱动，但环境和生活方式因素在其发生和进展中起关键作用。吸烟、饮酒、嚼槟榔、慢性炎症及人乳头瘤病毒感染是公认的危险因素。越来越多的证据表明，这些环境暴露中的许多通过表观遗传机制，特别是DNA甲基化，发挥其致癌作用。异常的表观遗传改变通过失调基因表达并破坏细胞周期调控、DNA修复、细胞黏附、信号转导、凋亡及细胞分化等基本生物学过程，参与肿瘤的发生和进展。
组织活检的组织病理学评估仍是OSCC诊断的金标准。然而，非侵入性诊断方法的开发日益受到关注，包括液体活检、光学成像系统、口腔刷拭细胞学、微流控技术、纳米技术检测平台及人工智能辅助图像分析。其中，液体活检因能够在唾液和血液等易获取的体液中评估肿瘤相关分子改变而成为有前景的策略。既往研究表明，启动子异常DNA甲基化在口腔癌变过程中频繁发生，且可能先于临床可检测的疾病出现，使DNA甲基化成为疾病检测和监测的有吸引力的候选生物标志物来源。
尽管已有越来越多的DNA甲基化生物标志物被提出用于OSCC，但尚无一种被转化为用于非侵入性检测的常规临床实践。因此，本研究旨在采用整合的全基因组甲基化和转录组学策略，优先筛选并独立验证基于DNA甲基化的OSCC候选生物标志物。研究人员通过整合全基因组DNA甲基化和转录组学数据、通路富集分析、生物学相关性及转化潜力，而非仅依据统计学排序，对候选基因进行优先排序。
二、研究内容与结论
本研究采用两阶段设计，包括全基因组发现阶段和独立验证阶段。发现阶段收集了6例原发性OSCC患者的配对肿瘤和邻近正常组织标本，用于全基因组DNA甲基化和全转录组基因表达分析。独立验证阶段收集了21例OSCC患者、22例OPML患者和16例健康对照的组织、唾液和血清样本。研究人员通过整合DNA甲基化、基因表达、通路富集、蛋白质-蛋白质相互作用分析、生物学相关性和转化适用性，从51个候选基因中优先筛选出EPHA5进行独立验证。
研究得出以下主要结论：全基因组分析鉴定出661个上调和577个下调基因，以及对应1,776个基因的2,431个差异甲基化区域。整合分析生成51个候选基因组合，EPHA5被优先筛选。EPHA5启动子高甲基化在66.7%的OSCC肿瘤中被检测到，28.6%的肿瘤中观察到启动子高甲基化伴随表达降低。甲基化也在54.5%的OPML病变及47.6%的OSCC患者唾液中检测到，但在健康对照中罕见。肿瘤EPHA5甲基化可显著区分OSCC与健康对照（AUC = 0.780，p = 0.004），唾液EPHA5甲基化亦可显著区分（AUC = 0.717，p = 0.025），而血清甲基化无显著诊断价值。OSCC与OPML之间的区分能力有限且未达统计学显著性。Kaplan-Meier生存分析显示中位总生存期为83.9个月，治疗组间无显著差异。通路富集分析将EPHA5定位于轴突导向信号通路，蛋白质-蛋白质相互作用分析预测其与Eph/ephrin信号、细胞黏附、细胞骨架组织及细胞内信号转导相关的多种蛋白质存在相互作用。
三、主要技术方法
研究人员采用的主要技术方法包括：Illumina HumanMethylation450 BeadChip进行全基因组DNA甲基化分析，Illumina HumanHT-12 v4 Expression BeadChip进行全基因组基因表达分析；定量甲基化特异性PCR（QMSP）验证EPHA5启动子甲基化；定量实时PCR（QRT-PCR）验证EPHA5基因表达；ChAMP包进行甲基化数据处理和差异甲基化区域鉴定；limma和lumi包进行基因表达数据分析；PathfindR包进行活性亚网络通路富集分析；STRING数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用网络；ROC曲线分析评估诊断性能。样本来源包括伊斯坦布尔大学医学院耳鼻咽喉头颈外科、伊斯坦布尔大学牙科学院口腔颌面外科。
四、研究结果
3.1 人口学、临床和病理特征：验证队列包括21例OSCC患者（平均年龄61.95岁，66.7%为男性）、22例OPML患者和16例健康对照。OSCC患者中原发肿瘤部位包括颊黏膜（38.1%）、舌（28.6%）、口底（23.8%）、磨牙后三角（4.8%）和硬腭（4.8%）。42.9%为IV期疾病，42.9%存在淋巴结转移，38.1%在随访期间出现复发。
3.2 全基因组甲基化和转录组分析：全基因组转录组分析鉴定出661个上调和577个下调基因。全基因组DNA甲基化分析显示OSCC中整体低甲基化占优势，有34,223个低甲基化和12,835个高甲基化差异甲基化探针。区域分析鉴定出2,431个差异甲基化区域，对应1,776个基因。
3.3 候选生物标志物鉴定：整合分析生成51个候选基因。EPHA5在发现队列中表现出显著的启动子高甲基化（Δβ = 0.1006，p = 0.002）伴随基因表达降低。独立验证显示，EPHA5启动子甲基化在66.7%的OSCC肿瘤组织中被检测到，在OPML病变中为54.5%。基因表达分析显示42.8%的OSCC肿瘤中EPHA5表达降低。28.6%的OSCC患者中观察到启动子高甲基化伴随表达降低的一致性模式。
3.4 临床关联、诊断性能和生存分析：肿瘤EPHA5甲基化可显著区分OSCC与健康对照（AUC = 0.780，p = 0.004；灵敏度71.4%，特异度75%）。唾液EPHA5甲基化亦可显著区分（AUC = 0.717，p = 0.025；灵敏度52.4%，特异度87.5%）。血清甲基化无显著诊断价值（AUC = 0.571，p = 0.462）。OSCC与OPML之间的区分未达统计学显著性。唾液甲基化与性别显著相关（p = 0.036）。Kaplan-Meier分析显示中位总生存期为83.9个月，治疗组间无显著生存差异。
3.5 通路富集和蛋白质-蛋白质相互作用分析：KEGG通路富集分析突出显示了轴突导向通路，其中包含EPHA5。STRING数据库分析预测EPHA5与EPHA1、EPHA4、EPHA6、EPHA7、EFNA1、EFNA2、EFNA3、EFNA5、EFNB2、FYN、SRC、RHOA、CBL、CDH1、PXN、STAT3、GJA1、ARHGDIA、ANLN和RTKN等多种蛋白质存在相互作用。
五、讨论与结论
讨论部分指出，EPHA5属于Eph受体酪氨酸激酶家族，该家族是受体酪氨酸激酶中最大的亚群，通过双向Eph/ephrin信号在胚胎发育、组织架构、细胞黏附、迁移和细胞间通讯中发挥基本作用。既往研究表明，EPHA5启动子高甲基化伴随表达降低已在乳腺癌和前列腺癌中得到证实，去甲基化药物处理后基因表达得以恢复，支持该受体的表观遗传调控。EPHA5蛋白表达降低与结直肠癌、肾癌、乳腺癌、膀胱癌、前列腺癌和卵巢癌的侵袭性临床病理特征及不良预后相关。EPHA5缺失在食管癌模型中促进细胞迁移和侵袭。外周血中检测到的甲基化EPHA5与胃癌风险增加相关。
本研究独立验证了EPHA5启动子甲基化和基因表达在OSCC、OPML和健康对照中的情况。EPHA5启动子甲基化在OSCC组织中频繁检测到，并在唾液中保持可检测，表明甲基化EPHA5 DNA可在口腔液体中鉴定。启动子甲基化也在超过一半的OPML病变中观察到。诊断分析显示，EPHA5启动子甲基化对区分OSCC与健康对照具有中等判别性能，但不能可靠区分OSCC与OPML。血清EPHA5甲基化诊断性能较差。EPHA5在OPML中较高的甲基化频率及其有限的区分能力提示该表观遗传改变可能在侵袭性疾病发展之前出现，并在口腔癌变的多个阶段持续存在。因此，EPHA5在风险分层和纵向监测方面可能比作为区分OSCC与癌前病变的独立生物标志物更有价值。
研究结论：频繁的肿瘤高甲基化以及可检测的唾液甲基化支持进一步评估EPHA5作为OSCC候选非侵入性表观遗传学生物标志物。然而，其中等诊断性能、对OSCC与OPML的有限区分能力以及缺乏外部验证表明，在临床实施之前，需要进行更大规模的前瞻性研究以及在多标志物甲基化组合中的评估。
