《Frontiers in Oncology》：Liquid biopsy using circulating miRNAs for the identification of recurrence-associated biomarkers in glioblastoma CNS WHO grade 4
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摘要专业翻译
引言： 胶质母细胞瘤（GBM）CNS WHO 4级（GBM）尽管采用当前的治疗方法，仍与不良预后和高复发率相关。常规影像学检查，特别是磁共振成像（MRI），主要用于随访期间检测肿瘤复发，但区分复发与治疗相关改变（如组织坏死和术后瘢痕组织）的能力有
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引言： 胶质母细胞瘤（GBM）CNS WHO 4级（GBM）尽管采用当前的治疗方法，仍与不良预后和高复发率相关。常规影像学检查，特别是磁共振成像（MRI），主要用于随访期间检测肿瘤复发，但区分复发与治疗相关改变（如组织坏死和术后瘢痕组织）的能力有限。使用循环肿瘤特异性血清学生物标志物（如miRNA）的液体活检，为早期识别GBM复发提供了基因表达特征。这项初步的“概念验证”研究探讨了全血样本中循环肿瘤来源miRNA用于早期检测肿瘤复发的潜力。
方法： 在先前的一项全转录组筛选（NGS）研究中，使用了来自七名患者的全血样本（n = 33）和肿瘤活检组织（n = 4）来鉴定生物标志物。对应于肿瘤手术和复发，研究人员检测了术前血液样本和肿瘤组织中的miRNA表达。在全血中，研究人员探究了是否能识别出一种模式，该模式指示术后下调（与肿瘤负荷减少一致），随后在复发时恢复到术前水平。研究人员鉴定了每位患者1–19种miRNA（共72种miRNA）显示出该模式。在本手稿中，研究人员展示了qRT-PCR验证结果。研究人员选择了由NGS研究鉴定的45种最有前景的miRNA，并使用qRT-PCR进行定量。此外，研究人员纳入了miR-21作为文献中报道的有前景的候选分子。为应对miRNA归一化的挑战，研究人员比较了五种归一化策略和未归一化的原始Ct值。
结果： 两种归一化方法（中位数ΔCt归一化和未归一化的原始Ct值）未显示出系统性偏差。根据归一化方法的不同，NGS与qRT-PCR之间的一致性范围为23.6%至27.9%。尽管在个体患者水平上NGS与qRT-PCR之间的一致性较低，但qRT-PCR鉴定了一组共有的24种在不同患者中差异调控的miRNA。值得注意的是，miR-424-3p和miR-362-5p在七名患者中的五名中共享，其次是miR-1307-3p和miR-22-5p，各有四名患者共享。有趣的是，miR-21在任何患者中均未显示出预定义的复发相关模式。
讨论： 基于血液的miRNA谱分析可能补充影像学在GBM患者纵向监测中的作用，尽管临床获益尚未得到证实，且需要在更大的独立队列中进行验证。
论文解读文章
研究背景与问题
胶质母细胞瘤（GBM）是中枢神经系统（CNS）中最常见且最具侵袭性的原发性恶性肿瘤，依据世界卫生组织（WHO）2021年修订的中枢神经系统肿瘤分类，属于CNS WHO 4级。尽管采用最大安全手术切除、术后放疗联合替莫唑胺同步及辅助化疗（即Stupp方案）的多模式治疗，患者预后仍然很差，中位总生存期约为12至15个月，五年以上长期生存并不常见。肿瘤复发几乎是必然发生的，并且是治疗失败和死亡的主要原因。
在临床管理中，准确且早期地检测肿瘤复发至关重要。目前最常用的监测手段是磁共振成像（MRI），但常规MRI在区分真正的肿瘤进展与治疗相关改变（如放射性坏死、假性进展和术后瘢痕）方面存在公认的局限性。当影像结果不明确时，组织活检仍是诊断的金标准，但重复的神经外科干预具有侵入性，并伴随出血、脑水肿、梗死和神经功能缺损等显著风险。因此，亟需补充性的、微创的诊断技术。
液体活检通过分析体液中的肿瘤特异性血清学生物标志物，成为一种有前景的肿瘤监测和追踪方法。液体活检具有非侵入性、能够通过全面的组织分析检测肿瘤分子异质性以及获取快速简便等优势。然而，大多数液体活检研究集中于从外周血中分离细胞外囊泡（EVs），该过程劳动密集、RNA产量低，难以在常规临床实践中实施。相比之下，全血转录组分析是一种实用且临床可行的替代方案。
研究目的与意义
作为概念验证研究，研究人员探讨了这种劳动密集度较低的方法以及全血样本用于液体活检生物标志物检测的适用性。研究人员旨在验证先前全转录组测序（NGS）筛选研究中鉴定出的、与GBM复发相关的循环miRNA候选生物标志物。开发这种液体活检方法有望增强疾病监测，实现更早、更个体化的临床决策，并补充传统影像学检查。
主要技术方法
研究人员在先前已发表的筛选阶段，对来自七名经组织学确诊为GBM CNS WHO 4级患者的全血样本（n = 33）和肿瘤活检组织（n = 4）进行了全转录组NGS分析。这些患者在2019至2023年间于慕尼黑工业大学（TUM）Rechts der Isar诊所接受治疗，均接受了Stupp方案标准治疗，并在随访期间出现经影像学确认的肿瘤复发。NGS筛选采用预定义的三步过滤策略：候选miRNA应在术前肿瘤和血液样本中均有表达；术后基因表达至少下调两倍；复发时表达上调至术前水平或更高。基于此筛选，研究人员应用预定标准从72种miRNA中选出45种进行验证，并额外纳入文献中与GBM相关的miR-21。验证阶段使用定制TaqMan?阵列卡（TACs）进行qRT-PCR，检测46种miRNA。为应对miRNA归一化挑战，研究人员比较了三种内源性参考基因（miR-103a-3p、miR-16-5p、18S rRNA）、中位数归一化、中位数ΔCt归一化以及未归一化原始Ct值共五种策略。采用2^-ΔΔCt方法计算差异基因表达（DGE），以术前血液样本为基线参考。
研究结果
3.1 使用TaqMan?阵列卡验证候选miRNA
研究人员对七名患者中鉴定出的45种miRNA以及额外纳入的miR-21共46种miRNA进行了qRT-PCR验证。所有46种miRNA均显示出线性动态范围内的扩增曲线，因此全部纳入后续分析。
3.2 miRNA归一化方法的评估
研究人员评估了五种归一化方法及未归一化原始Ct值的合理性。一种归一化方法若≥70%的检测miRNA相对于术前样本出现系统性上移或下移，则被认为存在偏差。结果显示，未归一化的原始Ct值和中位数ΔCt归一化表现出最一致且无系统性偏差的分布。相比之下，miR-103a-3p归一化的一致性最低（38.5%），miR-16-5p和18S rRNA归一化各有50%的偏差，中位数归一化有38.5%的偏差。因此，未归一化原始Ct值和中位数ΔCt归一化被确定为最可靠的两种方法。
3.3 使用qRT-PCR分析完整候选miRNA panel
所有46种候选miRNA均在所有七名患者中通过qRT-PCR进行了分析，无论该miRNA是否在个体患者的NGS筛选中符合标准。每位患者经NGS筛选出的候选miRNA数量从1到14不等。使用未归一化原始Ct值时，27.9%的NGS候选miRNA通过qRT-PCR成功验证，另有16.5%未满足NGS筛选标准但显示出预期纵向表达模式的miRNA。使用中位数ΔCt归一化时，NGS候选miRNA的验证率为23.6%，其余miRNA中有13.3%显示出预期模式。尽管NGS与qRT-PCR在个体患者水平上的一致性较低，但qRT-PCR鉴定了一组共有的24种在不同患者中差异调控的miRNA。其中miR-424-3p和miR-362-5p在七名患者中的五名中共享，miR-1307-3p和miR-22-5p各有四名患者共享。值得注意的是，miR-21在任何患者中均未显示出预定义的复发相关模式。
3.4 NGS与qRT-PCR结果的一致性
以患者1为例，研究人员比较了不同归一化方法下的qRT-PCR结果与NGS数据的吻合度。与预定义的合理性标准一致，未归一化原始Ct值和中位数ΔCt归一化均鉴定出了与NGS结果表达模式一致的miRNA。
讨论与结论
基于血液的miRNA谱分析可能补充影像学在GBM患者纵向监测中的作用。这项概念验证研究表明，使用全血样本进行miRNA检测是一种可行且劳动密集度较低的液体活检方法。研究鉴定出了一组共有的候选miRNA，特别是miR-424-3p、miR-362-5p、miR-1307-3p和miR-22-5p，它们在不同患者中显示出与肿瘤负荷变化一致的表达模式。然而，NGS与qRT-PCR之间的一致性较低，且miR-21这一文献中广泛报道的GBM相关miRNA未显示出预期的复发相关模式，这表明个体间异质性和方法学挑战仍然存在。研究人员强调，临床获益尚未得到证实，这些发现需要在更大的独立队列中进行验证。该研究为未来开发基于循环miRNA的GBM复发液体活检检测方法奠定了基础，但距离临床应用仍需进一步研究。
