《Frontiers in Immunology》：Effects of West Nile Virus on behavioral and cognitive performance, circadian body temperatures, cortical Aβ and p-tau pathology, and immune measures in human apoE and human amyloid precursor protein NL-G-F/human apoE mice
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：引言：人类载脂蛋白E（apolipoprotein E，apoE）存在三种异构体：E2、E3和E4。与E3相比，E4是阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）的风险因子。西尼罗病毒（West Nile Virus，WNV）可导致神经系统疾
：引言：人类载脂蛋白E（apolipoprotein E，apoE）存在三种异构体：E2、E3和E4。与E3相比，E4是阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）的风险因子。西尼罗病毒（West Nile Virus，WNV）可导致神经系统疾病，并产生与AD中观察到的部分神经病理和神经炎症。研究人员此前报道了表达含显性NL-G-F突变的人淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein，APP）并携带人apoE靶向替换（targeted replacement，TR）的中龄基因敲入（knock-in，KI）小鼠在暴露于WNV昆津株（Kunjin strain，KUNV）后，在行为、免疫、病理指标及昼夜节律体温方面的效应。NL-G-F/E4小鼠对KUNV诱导的认知损伤更易感，且皮层病毒载量持续时间更长；在同时表达显性NL-G-F AD突变APP和E4的小鼠中，皮层检测到病毒载量的小鼠数量多于同时表达E3的小鼠。鉴于NL-G-F及NL-G-F/apoE小鼠在6月龄时即表现出认知损伤和神经病理，且年龄是发展为AD的风险因素并调节AD中的免疫应答，本研究评估了较年轻小鼠中是否存在对KUNV暴露反应的基因型差异。为确定NL-G-F的存在是否为检测KUNV反应基因型差异所必需，以及/或是否调节对KUNV的反应，研究也纳入了E3和E4小鼠。与E3相比，E2降低了发展为AD的风险，且绝大多数AD在缺乏E3和E4的情况下可能不会发生，因此本研究也纳入了NL-G-F/E2小鼠。方法：研究人员将表达含显性NL-G-F突变的人APP的KI小鼠与人apoE TR小鼠杂交，使用中龄NL-G-F/E3和NL-G-F/E4小鼠评估KUNV暴露对行为改变表现、昼夜节律体温、病毒载量、神经病理以及皮层中三种在KUNV对脑功能有害效应中重要的免疫指标转录水平的作用。结果：在6月龄时即可观察到对KUNV暴露的各种指标存在apoE异构体依赖性反应，且这些反应在缺乏NL-G-F时大多比存在NL-G-F时更为显著。暴露后一周，KUNV处理apoE小鼠皮层不溶性p-tau水平低于PBS处理小鼠，但NL-G-F/apoE小鼠中无此差异。KUNV处理小鼠皮层可溶性p-tau水平高于PBS处理小鼠，且该效应在NL-G-F/apoE小鼠中比apoE小鼠更明显。KUNV处理小鼠的不溶性/可溶性p-tau比值低于PBS处理小鼠，且该效应在apoE小鼠中比NL-G-F/apoE小鼠更显著。讨论：这些结果与培养细胞中的研究结果一致，支持Aβ和p-tau可能具有抗病毒特性。
论文解读文章
研究背景与科学问题
阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）的核心病理特征包括由淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein，APP）生成的人淀粉样肽Aβ40和Aβ42所构成的淀粉样病理，以及过度磷酸化tau蛋白（hyperphosphorylated tau，p-tau）病理。近年研究提出，嗜神经病毒感染可能参与AD病理的发生与进展。单纯疱疹病毒1型（Herpes Simplex Virus 1，HSV-1）等病毒感染后，神经元培养中Aβ和p-tau水平升高，且这些分子被证实具有抗病毒特性。Aβ病理和tau过度磷酸化可能限制病毒在大脑中的复制和传播，但这种免疫与损伤反应很可能以行为和认知功能受损为代价。这一发现提示，在制定减少甚至消除p-tau和淀粉样病理的策略时需保持谨慎，因为可能使大脑更易受病毒感染或病毒再激活的影响。
人类载脂蛋白E（apolipoprotein E，apoE）存在三种主要异构体：E2、E3和E4。与E3相比，E2对AD风险具有保护作用，而E4则增加AD风险。Aβ与p-tau病理和病毒感染及传播之间的双向关系可能以异构体依赖性方式受apoE调节。例如，E4相较于E3限制病毒复制的能力较弱，这可能与E4携带者AD风险增加相关。西尼罗病毒（West Nile Virus，WNV）可导致严重且持久的神经系统疾病，并在海马初始感染后产生AD中可见的神经病理和神经炎症。研究人员此前在中龄表达人APP含显性NL-G-F突变且携带人apoE靶向替换（targeted replacement，TR）的小鼠中评估了WNV昆津株（Kunjin strain，KUNV）暴露的作用，发现NL-G-F/E4小鼠对KUNV诱导的认知损伤更易感，皮层病毒载量持续时间更长。鉴于NL-G-F及NL-G-F/apoE小鼠在6月龄时即表现出认知损伤和神经病理，且年龄是AD的风险因素并调节AD免疫应答，本研究旨在评估较年轻小鼠中是否存在对KUNV暴露反应的基因型差异，并确定NL-G-F的存在是否为检测基因型差异所必需或是否调节KUNV反应。因此研究纳入了E3、E4小鼠以及NL-G-F/E2、NL-G-F/E3和NL-G-F/E4小鼠。
研究内容与主要结论
研究人员使用表达人APP含显性NL-G-F突变的基因敲入（knock-in，KI）小鼠与人apoE TR小鼠杂交获得的小鼠模型，系统评估了KUNV暴露对行为表现、昼夜节律体温、皮层病毒载量、Aβ和p-tau病理以及免疫指标的影响。研究设置了两个分析队列：分析1包含较年轻小鼠（平均约6月龄），分析2包含较年轻和较年长小鼠（平均约8.9月龄）。所有小鼠在感染前接受腹腔温度传感器植入以实时监测体温。小鼠经腹腔注射1,000空斑形成单位（focus-forming units，ffu）KUNV或磷酸盐缓冲液（PBS）处理，感染后30天开始行为测试，包括旷场实验、常规Y迷宫、新物体识别和空间Y迷宫。行为测试结束后处死小鼠，收集皮层和海马组织进行病毒载量、Aβ、p-tau及细胞因子转录水平分析。
主要关键技术方法
研究采用了以下关键技术方法：第一，使用表达人APP含NL-G-F突变且携带人apoE靶向替换的KI小鼠模型，包括E2、E3、E4及NL-G-F/E2、NL-G-F/E3、NL-G-F/E4多种基因型，样本来源于俄勒冈健康与科学大学（Oregon Health & Sciences University）饲养的动物队列。第二，采用CubiSens?无线温度传感器植入腹腔，实现群居小鼠实时、准确的体温测量。第三，通过旷场实验、常规Y迷宫、新物体识别和空间Y迷宫等行为学范式评估活动水平、焦虑样行为、空间习惯化、自发交替和空间记忆等认知功能。第四，使用qRT-PCR检测皮层和海马组织中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、干扰素-γ（IFN-γ）和T细胞受体α链（TCR-α）的mRNA表达水平，并量化KUNV病毒基因组。第五，使用ELISA试剂盒检测皮层可溶性和不溶性Aβ40、Aβ42及小鼠p-tau（pS199）水平。第六，采用主成分分析（principal component analysis，PCA）探讨各行为任务表现、治疗、基因型、病理指标、免疫指标及体温之间的相互关系。
研究结果
旷场实验活动水平：在分析1中，E3和E4小鼠中KUNV处理组活动水平低于PBS处理组。在分析2中，NL-G-F/E3小鼠比NL-G-F/E2和NL-G-F/E4小鼠更活跃；在雄性NL-G-F/E3小鼠中KUNV处理组活动水平高于PBS组，而雄性NL-G-F/E4小鼠中KUNV处理组低于PBS组。雌性中NL-G-F/E3小鼠比NL-G-F/E2和NL-G-F/E4小鼠更活跃。
旷场实验中央停留时间：在分析1中，NL-G-F/E2小鼠在旷场中央停留时间少于NL-G-F/E3和NL-G-F/E4小鼠；E3小鼠比E4小鼠在中央停留时间更长。在分析2中，NL-G-F/E2小鼠中央停留时间少于NL-G-F/E3和NL-G-F/E4小鼠；NL-G-F/E2和NL-G-F/E4小鼠中KUNV处理组中央停留时间少于PBS组。
含物体旷场实验活动水平：在分析2中，NL-G-F/E3小鼠比NL-G-F/E2和NL-G-F/E4小鼠移动距离更长。在E3和E4小鼠中存在日×基因型×处理交互作用。
含物体旷场实验中央停留时间：在分析1和分析2中，NL-G-F/E2小鼠在含物体旷场中央停留时间少于NL-G-F/E3和NL-G-F/E4小鼠。在NL-G-F/apoE雌性小鼠中，KUNV处理组中央停留时间少于PBS组。
物体识别测试日物体探索时间：在分析1和分析2中，NL-G-F/E2小鼠探索物体的时间少于NL-G-F/E3和NL-G-F/E4小鼠。在分析2中，E3小鼠探索物体时间少于E4小鼠。
辨别指数：各分析中均未发现显著的基因型或处理效应。
常规Y迷宫臂进入次数：在分析1中，NL-G-F/E4小鼠中KUNV处理组有臂进入次数高于PBS组的趋势。分析2中未见显著效应。
常规Y迷宫自发交替：在分析1中，NL-G-F/apoE小鼠存在基因型×处理交互作用；E3和E4小鼠中KUNV处理组自发交替百分比低于PBS组。在分析2中，NL-G-F/E2小鼠自发交替百分比高于NL-G-F/E4小鼠；NL-G-F/E3和NL-G-F/E4小鼠中KUNV处理组自发交替低于PBS组；E4小鼠中KUNV处理组自发交替低于PBS组。
空间Y迷宫新臂停留时间：在分析1中，E3和E4小鼠中KUNV处理组在新臂停留时间多于PBS组。分析2中NL-G-F/apoE小鼠未见显著效应。
空间Y迷宫新臂进入百分比：各分析中均未发现显著的基因型或处理效应。
昼夜节律体温：分析1第一周，NL-G-F/E2小鼠光期体温在KUNV处理组高于PBS组；NL-G-F/E3小鼠暗期体温在KUNV处理组低于PBS组。第二周，NL-G-F/E2小鼠光期体温在KUNV处理组高于PBS组。分析2中，NL-G-F/E4小鼠光期体温在KUNV处理组低于PBS组。
皮层p-tau水平：在感染后6天检测皮层可溶性和不溶性p-tau水平。KUNV处理apoE小鼠皮层不溶性p-tau水平低于PBS处理小鼠，但NL-G-F/apoE小鼠中无此差异。KUNV处理小鼠皮层可溶性p-tau水平高于PBS处理小鼠，且该效应在NL-G-F/apoE小鼠中比apoE小鼠更明显。不溶性/可溶性p-tau比值在KUNV处理小鼠中低于PBS处理小鼠，且该效应在apoE小鼠中比NL-G-F/apoE小鼠更显著。
讨论与结论
本研究结果与培养细胞中的研究结果一致，支持Aβ和p-tau可能具有抗病毒特性的假说。KUNV暴露后皮层可溶性p-tau水平升高，而不溶性p-tau水平在apoE小鼠中降低，提示p-tau在病毒感染过程中可能发挥抗病毒作用，但这种免疫和损伤反应以行为表现为代价。研究还发现apoE异构体依赖性反应在6月龄时即可观察到，且大多在缺乏NL-G-F时比存在NL-G-F时更为显著。这些发现提示，在制定减少或消除p-tau和淀粉样病理的治疗策略时需谨慎，因为可能增加大脑对病毒感染的易感性或病毒再激活的风险。研究结论表明，KUNV暴露对行为、体温、病理和免疫指标的影响存在apoE异构体依赖性，且NL-G-F的存在调节了这些反应。
