《Genome Medicine》：Blood cell composition reveals distinct biological interpretation of DNA methylation age and age acceleration
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背景：表观遗传时钟（epigenetic clocks）是广泛使用的生物年龄标志物，但其生物学基础仍不清楚。研究人员此前显示表观遗传时钟受初始（na?ve）与记忆（memory）T细胞比例影响，提示全血细胞构成（blood cell composition）可
背景：表观遗传时钟（epigenetic clocks）是广泛使用的生物年龄标志物，但其生物学基础仍不清楚。研究人员此前显示表观遗传时钟受初始（na?ve）与记忆（memory）T细胞比例影响，提示全血细胞构成（blood cell composition）可能是驱动因素，但各细胞分数间存在共线性（collinearity）使分析困难。方法：研究人员首先开发对血细胞计数共线性稳健的主成分分析（principal component analysis, PCA）方法；随后在4058份样本中量化细胞构成对六类第一代或第二代表观遗传时钟所得DNA甲基化年龄（DNAmAge）与年龄加速（AgeAccel）的贡献；最后在18859人队列中检验细胞构成对AgeAccel与176种首发健康结局关联的影响。结果：多达53%的DNAmAge变异可归因于细胞计数，初始与记忆T细胞平衡贡献尤其强；AgeAccel与细胞计数关联较弱（最多解释21%方差），第二代时钟主要涉及中性粒细胞（neutrophils）。人工细胞混合实验验证细胞计数对时钟的贡献。细胞构成会显著削弱AgeAccel与176种首发健康结局的关联，但效应温和。结论：DNAmAge与AgeAccel在细胞构成关联上明显不同，至少部分反映不同生物学过程；令人意外的是，可归因于血细胞构成的AgeAccel变异对其与死亡及首发疾病结局的关联仅具次要贡献。
论文解读：《Genome Medicine》发表的细胞构成重释表观遗传时钟研究
研究背景方面，生物年龄标志物中的表观遗传时钟利用DNA甲基化（DNA methylation, DNAm）随年龄变化来估计日历年龄或健康相关复合指标。第一代时钟如Hannum、Horvath、Zhang时钟预测日历年龄；第二代时钟如PhenoAge、GrimAge、DunedinPACE预测与健康相关的生理退变速率。学界常把DNAmAge对日历年龄回归的残差即年龄加速（AgeAccel）解释为“生物年龄”超前或滞后。但“生物年龄”概念本身定义不清，时钟背后的生物学机制不明。研究人员此前发现初始T细胞、记忆T细胞及自然杀伤（natural killer, NK）细胞活化可驱动时钟进展，然而血细胞分数既存在生物学相关，又因总和为100%而产生数学共线性，单独估计某一细胞分数对结局的效应不可靠。现有细胞反卷积算法如EpiDISH、IDOL-extended虽能高分辨率估计免疫细胞比例，但共线性问题仍阻碍对DNAmAge与AgeAccel细胞驱动机制的定量解读，因此亟需新方法。
研究人员基于荷兰BIOS联盟6个生物样本库的全血450K甲基化数据，纳入4058份18至87岁样本；健康结局部分使用Generation Scotland队列18859人、176种首发结局（含全因死亡）。研究先用EpiDISH反卷积得到12类血细胞比例，再构造11个细胞构成主成分（PCs），用无截距或多变量模型处理“某细胞升高1个标准差而其他细胞按比例缩小”的情景，并以GEO中分选血细胞数据集GSE167998做计算机模拟人工细胞混合验证；健康结局分析采用Cox回归与似然比检验比较未校正和加入11个细胞构成PCs后的模型。
数据集和细胞计数部分，研究人员在4058份全血样本中用EpiDISH估计中性粒细胞、嗜酸粒、嗜碱粒、单核、初始/记忆B细胞、初始/记忆CD4 T、初始/记忆CD8 T、调节性T细胞（Tregs）、NK细胞共12类。结果显示中性粒细胞平均占比最高，初始T细胞随年龄负相关，记忆T细胞随年龄正相关。
Analysis of cell fractions is complicated by collinearity部分，单变量模型中各分数与年龄显著相关，但因分数总和固定，多变量模型必须舍弃一个分数，导致其效应被并入截距，剩余分数效应方向随被舍弃分数不同而发生剧烈反转，说明传统单/多变量方法不能给出稳定个体分数效应，但所有模型解释年龄方差均为43.5%。
PCA-based method enables collinearity-free investigation of cell composition部分，研究人员由12个分数提取11个正交PCs，PC1对应中性粒细胞，PC2对应初始/记忆T细胞平衡，PC2、PC6、PC7与年龄最强相关；剔除PC2后其余PC效应不变、仅总解释方差下降，证明PCA可无共线性地解释细胞构成与年龄关系。
Na?ve and memory T cells are strongly associated with age and DNAmAge but not AgeAccel部分，Horvath等时钟的DNAmAge强烈关联PC2/PC6/PC7（初始/记忆T细胞），但对应AgeAccel关联大幅减弱甚至反向；不同时钟AgeAccel受细胞构成影响不同，Horvath与Zhang较独立，Hannum、PhenoAge受T细胞与中性粒细胞共同影响，GrimAge、DunedinPACE主要受中性粒细胞影响。
Artificial cell mixtures suggest that cell composition drives epigenetic clocks部分，研究人员在真实样本和GSE167998体外分选数据中都发现：初始CD4/CD8 T细胞升高使Hannum、PhenoAge、GrimAge、DunedinPACE的AgeAccel下降，中性粒细胞升高使其AgeAccel上升；Horvath、Zhang的AgeAccel几乎不被细胞构成扰动影响，说明部分时钟AgeAccel确由细胞构成驱动。
Cell composition and the association of epigenetic clocks with incident health outcomes部分，在Generation Scotland中，细胞构成整体与死亡、哮喘、非霍奇金淋巴瘤等12种结局显著相关；PC1（中性粒细胞）关联死亡。把11个细胞构成PCs加入Cox模型后，6个时钟中4个的AgeAccel与176种结局的HR被削弱，但衰减幅度仅约2%至7%，死亡结局衰减为1%至6%。
讨论部分指出，日历年龄/DNAmAge主要映射初始到记忆T细胞转换，而Hannum、PhenoAge、GrimAge、DunedinPACE的AgeAccel更依赖中性粒细胞，说明“年历增龄1年”和“AgeAccel增1年”的生物学含义并不等价，把AgeAccel直接等同于生物年龄存在概念风险。Horvath与Zhang的AgeAccel弱关联细胞构成，可能被解释为更具细胞内在老化信息，但EpiDISH未覆盖效应/耗竭T细胞等亚群，因此不能完全排除未测细胞类型贡献。细胞构成对健康结局的预测有真实信号，但不足以解释AgeAccel与发病/死亡的大部分关联，故AgeAccel还捕获了非细胞构成驱动的健康相关甲基化过程。
结论部分翻译如下：DNAmAge与AgeAccel在和细胞构成的关联上明显不同，表明它们至少在一定程度上反映不同生物学过程。令人惊讶的是，可归因于全血细胞构成的AgeAccel变异，对其与死亡率及首发疾病结局的关联仅起到次要贡献。
