单细胞RNA测序（scRNA-seq）重塑蚊虫生物学与宿主–病原体互作研究：从细胞图谱到靶向媒介控制

《Parasites & Vectors》：Single-cell RNA sequencing unravels mosquito biology and host–pathogen interactions

单细胞RNA测序（scRNA-seq）凭借高分辨率转录组图谱分析能力，正在从根本上重塑蚊虫生物学与宿主–病原体相互作用的研究范式。本综述首先概述scRNA-seq的技术流程与数据分析策略，继而重点阐述scRNA-seq在构建蚊虫细胞图谱、解析血餐后转录重塑、性二态性及受体共表达模式中的关键应用。此外，讨论scRNA-seq在揭示蚊媒病原体细胞嗜性、宿主免疫反应及潜在干预靶点识别中的作用。尽管当前仍面临缺乏特异性细胞标志物和功能验证不足等挑战，scRNA-seq为在单细胞水平理解蚊虫生物学提供了新视角，并为开发靶向媒介控制策略奠定了重要基础。展望未来，与空间转录组学（spatial transcriptomics）、多组学（multiomics）方法及动态实验验证的整合，将进一步推动该领域向机制研究与转化应用发展。

Background（背景）
蚊媒传染病如疟疾、登革热和基孔肯雅热对全球公共卫生构成严重威胁。传统整组织或候选基因研究难以精确解析蚊虫生物学及蚊–病原体互作。单细胞RNA测序（scRNA-seq）通过将蚊虫组织解构为单个细胞类型，为机制研究和干预靶点发现提供新途径。当前已应用于埃及伊蚊（Ae. aegypti）、冈比亚按蚊（An. gambiae）和斑跗库蚊（Cx. tarsalis），建立中肠、脂肪体、血细胞和神经系统细胞图谱，发现新细胞亚群，解析寨卡病毒（ZIKV）、西尼罗病毒（WNV）和疟原虫（Plasmodium）的细胞嗜性。但组织覆盖不全、依赖果蝇（Drosophila）同源注释及功能验证不足仍限制进展。本综述旨在评估scRNA-seq如何重塑蚊虫生物学认识。

Overview of scRNA-seq technology（scRNA-seq技术概述）
Single-cell isolation, library construction, and sequencing（单细胞分离、文库构建和测序）：标准流程包括组织解剖或血淋巴收集、单细胞/细胞核分离、捕获、文库构建、高通量测序和数据分析。从复杂蚊虫组织获得高活力、无偏的单细胞或细胞核悬液是关键。解离方案需优化以减少应激诱导转录假象。脑或脂肪体等难解离组织可用单核RNA测序（snRNA-seq），其直接从冻存或新鲜组织分离细胞核，避免酶解应激并保留细胞类型比例，但会丢失胞质转录本，并可能低估低核质比细胞。scRNA-seq需完全解离，可能引入解离假象及脆弱或大细胞丢失。细胞/细胞核裂解后释放RNA，经捕获、逆转录和扩增；独特分子标识符（UMI）可数字化定量原始转录本并减轻聚合酶链反应（PCR）扩增偏倚。平台选择涉及转录组深度与细胞通量平衡：Tang法、Smart-seq2等近全长覆盖但通量低；10× Genomics Chromium等液滴系统可分析数万细胞但牺牲全长覆盖。短读长（如Illumina）准确高通量但常仅捕获3′或5′端；长读长（如PacBio Iso-Seq、Oxford Nanopore）可完整覆盖mRNA，利于剪接分析和发现新异构体。
Data analysis（数据分析）：标准流程包括读段比对、质控、标准化、降维、聚类、差异表达、细胞类型注释和富集分析。缺乏蚊虫细胞标志物数据库，常需依赖果蝇同源基因推断。以An. gambiae中肠为例，FASTQ经Cell Ranger v.7.0.1比对至PEST基因组，Scanpy质控过滤complexity score小于0.7或大于30%线粒体reads，SeuratDisk转换，选top 25%可变基因，PCA，RPCA整合，UMAP，Louvain聚类（resolution=0.3），FindAllMarkers（log₂FC大于1）鉴定标志物，参考Fly Cell Atlas等注释，AggregateExpression和DESeq2进行伪bulk差异表达，gProfiler富集。工具需匹配设计，如10× Chromium用Cell Ranger，Smart-Seq2用STAR等。

Research progress of scRNA-seq in mosquito research（scRNA-seq在蚊虫研究中的进展）
Construction of mosquito cell atlases（蚊虫细胞图谱构建）
Redefinition of cell subtypes（细胞亚型重新定义）：传统形态学难以区分功能不同但形态相似细胞。在An. gambiae血细胞中，经典granulocytes、oenocytoids、prohemocytes被扩展为功能多层系统；granulocytes包含conventional、proliferative、antimicrobial、phagocytic及megacyte等亚型，megacyte被认为协调血细胞分化因子（HDF）介导的免疫应答。Megacyte在Ae. aegypti未检测到，提示媒介物种细胞谱系差异。中肠上皮原分为肠上皮细胞（ECs）、肠内分泌细胞（EEs）和干/祖细胞，现揭示ECs和EC-like细胞分为五个亚型，富集不同消化酶如trypsin、chymotrypsin或免疫因子；EEs分为三个亚型，特化于不同神经肽信号或化学感觉通路。
Discovery of novel cell populations（新细胞群体发现）：在血餐后Ae. aegypti脂肪体中发现脂肪体卵黄细胞（FYCs），共表达脂肪体代谢和卵巢生殖标志物，以及干细胞基因klu、Delta和卵壳形成基因Nasrat。其血餐后持续存在，提示维持生殖准备状态，但转录身份不等于功能验证。唾液腺、睾丸和神经系统也建立图谱，新细胞群如高表达CCC2和GPRNPY6的唾液腺细胞仍待功能验证。
Technical variations and interpretation challenges（技术变异与解释挑战）：技术选择影响图谱。10× Chromium高通量捕获稀有megacyte（0.5%），Smart-Seq2虽通量低但灵敏度高，可鉴定phagocytic granulocytes。中肠EC亚型数目差异可能源于解离方法、采样时间或聚类参数。区分生物学发现与技术假象需遵循minSCe指南，记录技术参数和计算流程，并用RNA fluorescence in situ hybridization（RNA FISH）或蛋白染色验证新细胞类型。

Elucidating biological processes（阐释生物学过程）
Post-blood-meal transcriptional remodeling（血餐后转录重塑）：中肠scRNA-seq显示血餐后1天出现三个新生肠上皮簇，从0.4%增至52.2%，其来源可能为现有EC转分化或enteroblasts。代谢通路上调，但某些EC亚群中trypsins等消化酶基因下调，提示非均匀调控。脂肪体在2–7 dpbm，trophocyte 1比例下降，trophocyte 2和3中海藻糖合成基因Tps1、Tpp和免疫调节因子Vago-like上调。血细胞比例在7 dpbm翻倍，granulocytes高表达免疫和角质层基因；FYCs稳定表达Nasrat和PIWI通路基因。脑snRNA-seq显示血餐后3小时胶质细胞变化最大，类固醇激素受体E75、EcR和昼夜节律钟基因PER上调。
Cellular basis of sexual dimorphism（性二态性的细胞基础）：Ae. aegypti脑中雌性富集Kenyon cells 2、多巴胺能神经元和投射神经元，雄性富集特定胶质、近端髓质神经元和Kenyon cells 3。雄性高表达Nix和神经肽Y受体，雌性高表达二肽基肽酶和信号受体Pka-R1。dsx在胶质细胞中高于神经元，提示胶质细胞参与性身份。外周感觉器官中雄性触角ppk317⁺上皮样细胞和雌性喙Ir7e⁺神经元，为性别特异行为提供细胞关联。
Receptor coexpression and sensory coding（受体共表达与感觉编码）：Ae. aegypti感觉神经元snRNA-seq揭示不同基因家族受体共表达，挑战“一神经元一受体”。嗅觉器官中Ir25a常与odorant receptors（ORs）共表达，Orco和Ir25a在超过10%神经元中共检测到。味觉跗节中低盐传感器ppk301与甜味受体Gr7/Gr9共表达，一些味觉神经元还表达热感受受体TrpA1。转录共表达不等同功能互作，需电生理和行为研究。

Decoding host–pathogen interactions（解析宿主–病原体互作）
Technical adaptation for pathogen detection（病原体检测技术适配）：传统scRNA-seq可能将非宿主reads作为污染过滤，丢失病原体信息。同步分析宿主和病原体转录组很重要。黄病毒RNA常缺poly(A)尾，5′ capture scRNA-seq可克服，成功捕获Ae. aegypti中肠ZIKV转录本。
Cellular tropism of mosquito-borne pathogens（蚊媒病原体细胞嗜性）：目前仅三项研究在单细胞分辨率直接研究蚊虫宿主–病原体互作。Ae. aegypti中肠ZIKV优先靶向EEs和ECs；Cx. tarsalis中肠WNV在EEs中载量最高，提示EEs对黄病毒保守易感。WNV感染中肠中肠道干细胞/肠母细胞病毒RNA最低，提示内在抗性。Plasmodium感染An. gambiae中，双重scRNA-seq显示动合子在穿越中肠上皮时优先与祖细胞互作，跨物种保守，可能是传播阻断靶点。
Dissecting anti-pathogen immune responses（解析抗病原体免疫应答）：ZIKV感染Ae. aegypti中肠中，ECs高表达抗菌肽如Gambicin。WNV感染Cx. tarsalis中，感染细胞内免疫基因表达与病毒载量相关，但无广泛组织水平免疫激活，中肠固着血细胞数量无显著变化，挑战中肠是先天免疫激活关键位点的传统观点。HDF增强抗疟免疫，scRNA-seq发现LL3在稀有megacyte高表达，RNA干扰（RNAi）证明LL3对HDF介导应答必需。
From observation to intervention（从观察到干预）：scRNA-seq能产生可检验机制假设。ZIKV感染EEs中apolipophorin III富集，RNAi验证其支持ZIKV复制。megacyte和LL3发现促进血细胞分化可塑性研究。未来时间序列和双scRNA-seq可映射互作网络。

Conclusions（结论）
scRNA-seq将蚊虫组织解构为细胞类型，从组织平均水平转向细胞异质性。当前挑战包括依赖Drosophila同源注释可能误注，细胞图谱跨物种器官不完整如卵巢、复眼，且大量转录假设需功能验证。未来应扩展图谱，整合空间转录组学和单细胞多组学，构建空间分辨基因调控网络，预测互作，识别干预靶点，并通过动态扰动实验验证。scRNA-seq正从发现工具成熟为靶向媒介控制平台。