Ste20样激酶（SLK）依赖信号网络协调皮层神经元细胞骨架与突触发育：MINK1和TNIK为直接底物并关联KCNQ2依赖性网络兴奋性

《Cell Communication and Signaling》：Identification of a Ste20-like kinase-dependent signaling network orchestrating cytoskeletal and synaptic development of cortical neurons

　　

背景：Ste20样激酶（Ste20-like kinase, SLK）是一种丝氨酸/苏氨酸激酶（serine/threonine kinase），在非神经元细胞中调节细胞骨架组织、凋亡和细胞极性。在神经元中，SLK引导树突形态发生和抑制性突触稳定性，从而通过小清蛋白中间神经元（parvalbumin interneuron）功能控制兴奋-抑制平衡（excitation-inhibition balance）。在致癫痫性皮质发育不良（epileptogenic cortical dysplasias）的畸形神经元（dysmorphic neurons）中SLK几乎完全缺失，提示该激酶在神经发育障碍（neurodevelopmental disorders）中具有功能。然而，其神经元信号机制仍知之甚少。方法：为填补这一知识空白，研究人员将针对候选SLK相互作用蛋白的亲和纯化-质谱（affinity purification-mass spectrometry, AP-MS）筛选与SLK敲低（knockdown, KD）后的定量磷酸化蛋白质组学（quantitative phosphoproteomics）相结合，以鉴定皮层神经元中潜在的SLK相互作用因子和SLK依赖性磷酸化图谱。结果：在两个数据集中，研究人员鉴定了数百种候选SLK结合蛋白以及SLK KD后超过1,000个受调控磷酸化位点（phosphosites）。这些数据集共同指向参与肌动蛋白（actin）和微管（microtubule）调控、细胞黏附（cell adhesion）和突触稳定性（synaptic stability）的细胞骨架、突触和信号蛋白。研究人员将两种生发中心激酶（germinal center kinase, GCK）家族激酶MINK1和TNIK鉴定为SLK在激活环苏氨酸（activation-loop threonine, T¹⁸¹）处的直接底物，提示SLK可能作用于一个与树突发育相关的GCK激酶通路的上游。在功能上，SLK KD还改变了自发网络活动（spontaneous network activity），改变了KCNQ2的磷酸化模式，并增加了神经元网络对KCNQ2阻断（KCNQ2 blockade）的敏感性。结论：这些数据将SLK定位于一个广泛的神经元信号网络中，该网络将细胞骨架和突触调控与激酶信号及神经元兴奋性联系起来。虽然对KCNQ2的影响似乎是间接的，但MINK1和TNIK作为直接SLK底物出现。

该论文发表于《Cell Communication and Signaling》。磷酸化可调节蛋白活性、定位、稳定性和相互作用，从而塑造细胞行为。在神经系统中，激酶调控轴突和树突发育，包括树突生长、分支、稳定和突触形成，决定神经元连接和功能。STE20家族激酶包括生发中心激酶（germinal center kinase, GCK）和p21激活激酶（p21-activated kinase, PAK），调节神经元形态和信号。PAK介导Rho家族GTP酶下游信号，参与神经元极化、轴突发育、树突分枝和树突棘形态发生，并与智力障碍（intellectual disability, ID）和自闭症谱系障碍（autism spectrum disorder, ASD）相关。GCK亚家族成员通过控制细胞骨架组织及树突和突触发育调节神经元架构。SLK属于STE20激酶GCK-V亚家族，最初在非神经元细胞中表征，控制黏着斑周转、肌动蛋白重塑、细胞迁移和凋亡。越来越多证据表明SLK在发育神经系统中调节树突分支和抑制性突触稳定性。SLK缺失减少高阶树突分支，选择性降低抑制性突触密度，不影响兴奋性突触密度；SLK敲低神经元中微小抑制性突触后电流（miniature inhibitory postsynaptic currents, mIPSCs）频率和诱发抑制性突触后电流（evoked inhibitory postsynaptic currents, IPSCs）振幅降低，改变兴奋-抑制平衡。SLK在人类局灶性皮质发育不良（focal cortical dysplasia）畸形神经元中表达降低，且SLK变异见于神经发育障碍患者。然而，将SLK与神经元结构和兴奋性联系起来的分子步骤仍不清楚，神经元底物和信号伙伴大多未知。因此，研究人员开展本研究。

关键技术方法概括：研究人员结合两种互补蛋白质组学策略，用脑裂解液进行亲和纯化-质谱（affinity purification-mass spectrometry, AP-MS）筛选候选SLK结合蛋白，并在培养皮层神经元中进行SLK敲低后的定量磷酸化蛋白质组学。样本来源包括胚胎第16–19天（E16–19）小鼠皮层原代神经元、15–30周龄C57BL/6小鼠全脑裂解液以及HEK293T细胞。关键技术还包括液相色谱-串联质谱（LC–MS/MS）、TMT10plex标记、多电极阵列（multi-electrode array, MEA）记录、体外激酶反应、共免疫沉淀（co-immunoprecipitation, co-IP）和KinSwing激酶基序分析。生物信息学分析使用DAVID、SynGO、STRING和Cytoscape等。

研究结果：
1. 鉴定候选SLK相互作用蛋白和神经元SLK依赖性磷酸化蛋白质组。通过AP-MS，研究人员从脑裂解液中鉴定候选SLK结合蛋白；单个凝胶条带中679个显著富集蛋白里，372个（55%）也在全泳道分析中检测到。高富集蛋白包括Neurexin 3（NRXN3）、Glypicans（GPC1、5、6）、MINK1、TNIK以及TMEFF1和TMEFF2。GO分析显示候选蛋白富集于突触组织、细胞连接组装、细胞骨架动力学和GTP酶介导信号；疾病注释显示与癫痫和智力障碍（ID）相关。通过磷酸化蛋白质组学，SLK敲低效率降低93%，主成分分析显示对照与SLK KD明显分离；548个位点磷酸化显著增加，512个位点显著减少。减少的磷酸化蛋白包括细胞骨架相关MAP1B、NEFH、CRMP1以及突触相关SV2A、CHL1。SynGO分析显示前、后突触蛋白富集，尤其位于突触后区的膜相关蛋白；差异磷酸化的突触后密度蛋白形成紧密互作网络。整合两个数据集发现，三分之一差异磷酸化蛋白至少在一个AP-MS方法中检测到，约13–22%共免疫沉淀蛋白也显示显著磷酸化变化。候选直接底物包括MAP1B、MAP2、SV2A、GIT1、SHISA7、MINK1和TNIK。共免疫沉淀验证CRMP1、MINK1、TNIK和SHISA7可与SLK结合。结论：SLK结合并直接或间接影响突触、细胞骨架和树突蛋白网络的磷酸化状态。
2. SLK KD与自发网络活动改变及对KCNQ2阻断敏感性增加相关。通过MEA记录，研究人员在DIV15、18和21检测自发活动。SLK KD神经元在DIV15加权平均放电率显著增加，至DIV21下降；DIV15和DIV18爆发持续时间较长，所有时间点每爆发spike数增加；活跃电极数和细胞活力未变。通过过滤磷酸化蛋白质组学数据，发现钾通道和钙通道亚基磷酸化改变，其中KCNQ2差异磷酸化位点最多；AP-MS也检测到KCNQ2。在DIV21应用KCNQ2抑制剂ML252后，对照神经元加权平均放电率基本不变，而SLK KD神经元降低超过一半；ML252还更大程度降低SLK KD神经元的爆发持续时间和每爆发spike数。结论：SLK缺陷神经元网络对药理KCNQ2抑制的敏感性增加。
3. SLK的底物共识基序。研究人员基于已验证底物建模SLK磷酸化基序，分别生成丝氨酸、苏氨酸及合并S/T基序。丝氨酸和苏氨酸基序差异明显：丝氨酸周围主要为极性非带电氨基酸，苏氨酸周围主要为碱性氨基酸。通过KinSwing分析，SLK KD后显著低磷酸化位点中，9种激酶（AURKA、SGK1、PRKCH、PRKD2、FER、PRKG2、GRK1、PRKCG、PRKCZ）预测活性降低；55个位点具有较高概率被SLK磷酸化，包括MAP1B、MAP2、NCAM1、MAPRE3和SHISA7。部分位点如MAP1B_S¹⁸⁵⁶、MAP2_S¹⁶⁵⁴、NAV1_S⁵¹⁰预测对SLK高度特异；NAV1_S⁶⁵¹是S基序最佳命中，MINK1、TNIK和MAP4K4的T¹⁸¹:T¹⁸¹:T¹⁸⁰是合并ST和T基序最佳命中。结论：该分析鉴定出候选直接磷酸化底物。
4. 激酶MINK1和TNIK是SLK直接底物。通过体外激酶反应结合质谱，研究人员在仅含SLK反应中检测到MAP1B、MAP2、MINK1、NAV1、NEFH和TNIK的磷酸化位点。MINK1_T¹⁸¹和TNIK_T¹⁸¹与神经元磷酸化蛋白质组学中检测的磷酸肽对应。靶向质谱确认SLK特异性磷酸化MINK1和TNIK的T¹⁸¹，该位点位于激酶结构域激活环；无SLK对照中未检测到，排除了自磷酸化。MINK1和TNIK共享70%氨基酸序列，C端citron同源结构域和N端激酶结构域相似。二者已知参与树突生长，敲低任一激酶导致树突树复杂性降低。结论：SLK可能作用于MINK1和TNIK信号上游。

讨论部分总结：该研究绘制了SLK信号的两个互补层面：基于脑裂解液的AP-MS定义候选SLK结合蛋白，皮层神经元磷酸化蛋白质组学鉴定SLK缺陷诱导的磷酸化变化。二者交集指向SLK在突触和细胞骨架信号中的作用，生化实验鉴定MINK1和TNIK为直接SLK底物。SLK缺陷还与网络活动改变、KCNQ2磷酸化改变及对KCNQ2阻断敏感性增加相关；但与MINK1和TNIK不同，SLK对KCNQ2位点似乎是间接调控，可能通过激酶和磷酸酶信号网络实现。AP-MS和磷酸化蛋白质组学可区分结合且磷酸化改变、结合但无磷酸化变化、以及磷酸化受直接或间接调控但不结合SLK的蛋白；整合后可区分潜在直接底物和间接下游效应器。研究鉴定大量树突、细胞骨架和突触蛋白，包括NRXN1、LPHN3、RIM1、SYN1、SYNGAP1、SHISA6、SHISA7、SV2A等。SHISA7被验证为直接相互作用因子，SLK KD后S²⁵⁰磷酸化降低，SHISA7调节GABA_A受体运输，其敲低降低mIPSCs频率，与SLK KD表型相似。CRMP1被验证为直接结合伙伴，SLK KD后S⁵¹⁸和S⁵²²磷酸化降低，S⁵²²由CDK5、S⁵¹⁸由GSK3B磷酸化，可减少其与微管相互作用。信号分子包括Ras通路、Rho家族鸟嘌呤核苷酸交换因子、激酶和磷酸酶调节蛋白。SLK是首个报道可磷酸化MINK1和TNIK T¹⁸¹的激酶；T¹⁸¹和T¹⁸⁷磷酸化对TNIK催化激活必要，MINK1同源位点可能类似。MINK1和TNIK属于GCK，富集于突触后，控制树突形态，调节肌动蛋白、Hippo、MAPK或JNK信号；敲低减少树突分支，类似SLK KD，支持SLK通过磷酸化激活MINK1和TNIK以传播树突生长信号的模型，但需进一步验证。离子转运蛋白和膜蛋白也结合SLK并显示磷酸化改变，提示SLK信号还可能调节膜兴奋性和离子稳态。MEA显示SLK KD后爆发延长和每爆发spike数增加，可能提示终止网络活动的机制受损。KCNQ2（K_v7.2）是M型钾通道亚基，控制动作电位发放和爆发动态；其功能受PKC、ERK、PKA、CDK5、p38 MAPK和GSK3B等磷酸化调节。研究中检测到8个差异磷酸化KCNQ2位点：S⁵²、S⁴⁰⁴、S⁴¹⁸、S⁴²⁹、S⁴⁴⁸、S⁴⁵⁷、S⁴⁸³和S⁶⁸¹；PKA磷酸化S⁵²增加M电流，S⁴²⁹、S⁴⁴⁸、S⁴⁵⁷位于磷脂酰肌醇4,5-二磷酸（PIP₂）结合域。大多数差异位点磷酸化增加，提示KCNQ2可能位于一个或多个SLK调节的激酶/磷酸酶通路下游。KCNQ2功能障碍是早发癫痫和发育性脑病的原因，癫痫相关变异在MEA中表现为爆发中spike比例增高和爆发持续时间延长，类似SLK KD。SLK网络中的蛋白还与神经发育疾病相关，SLK表达在局灶性皮质发育不良和神经节胶质瘤畸形神经元中降低，SLK基因新发突变见于ID、ASD等患者，患者来源SLK变异可导致激酶活性丧失和神经元功能受损，并与隐性神经发育综合征相关。局限包括：AP-MS使用固定化SLK和成年小鼠全脑裂解液而非内源性神经元SLK复合物，可能包含情境依赖相互作用；磷酸化蛋白质组学依赖一种已验证shRNA，不能完全排除脱靶。下一步需鉴定控制神经元SLK活性的信号，并在不同发育阶段体内绘制SLK底物全谱。

研究结论翻译：这些数据将SLK定位于一个广泛的神经元信号网络中，该网络将细胞骨架和突触调控与激酶信号及神经元兴奋性联系起来。虽然对KCNQ2的影响似乎是间接的，但MINK1和TNIK作为直接SLK底物出现。