T细胞衔接器（BiTE）与γδT细胞联合治疗策略：基于PSMA/CD3双特异性抗体的前列腺癌免疫疗法优化

《Food Production, Processing and Nutrition》：Ultrasound-targeted delivery of total extracts from Abelmoschus Manihot (L.) alleviates radiation-induced cardiomyocyte ferroptosis via the NOX4/SLC7A11/GPX4 axis

　　

前列腺癌（prostate cancer, PCa）是全球男性第二大常见恶性肿瘤，尽管雄激素剥夺疗法（androgen deprivation therapy, ADT）等传统治疗手段取得了一定进展，但转移性去势抵抗性前列腺癌（metastatic castration-resistant prostate cancer, mCRPC）患者的预后仍极差，五年生存率不足30%。近年来，双特异性T细胞衔接器（bispecific T-cell engager, BiTE）作为一种新型免疫治疗策略展现出潜力，但其在实体瘤中的应用受到肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）免疫抑制特性的限制。本研究旨在探索将靶向前列腺特异性膜抗原（prostate-specific membrane antigen, PSMA）的BiTE与扩增的γδT细胞联合使用的可行性，以增强对PCa细胞的杀伤效果。研究人员首先设计并表达了靶向PSMA和CD3的双特异性抗体（PSMA×CD3 BiTE），随后从健康供体外周血中分离并扩增了Vγ9Vδ2 T细胞。通过体外细胞毒性实验、流式细胞术（flow cytometry）和酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）评估了联合疗法的抗肿瘤活性及免疫激活效应。结果显示，PSMA×CD3 BiTE能够有效桥接γδT细胞与PSMA阳性PCa细胞，显著增强γδT细胞的细胞毒性和干扰素-γ（interferon-γ, IFN-γ）分泌水平，且该效应呈剂量依赖性。此外，联合处理组中γδT细胞的活化标志物CD69和CD25表达上调，而PD-1表达无显著变化。研究表明，PSMA×CD3 BiTE联合扩增的γδT细胞可克服TME的部分免疫抑制，为mCRPC提供一种潜在的新型过继细胞免疫治疗策略。

论文解读文章

一、研究背景与科学问题

前列腺癌（prostate cancer, PCa）作为全球男性发病率第二高的恶性肿瘤，其临床管理面临重大挑战。虽然早期PCa可通过手术或放疗获得良好控制，但一旦进展至转移性去势抵抗性前列腺癌（metastatic castration-resistant prostate cancer, mCRPC），患者的中位总生存期通常不足3年。现有治疗手段如化疗、新型内分泌药物及放射性核素治疗虽能延缓疾病进展，但难以实现根治性缓解。近年来，以双特异性T细胞衔接器（bispecific T-cell engager, BiTE）为代表的免疫治疗策略在血液肿瘤中取得了突破性疗效，然而其在实体瘤中的应用受限于肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）的免疫抑制特性，包括调节性T细胞（regulatory T cell, Treg）浸润、转化生长因子-β（transforming growth factor-β, TGF-β）和白细胞介素-10（interleukin-10, IL-10）等抑制性细胞因子的富集，以及效应T细胞功能耗竭。

与此同时，γδT细胞因其固有的MHC非限制性识别能力和强大的溶瘤活性而成为过继细胞免疫治疗的候选效应细胞。特别是Vγ9Vδ2 T细胞亚群，能够通过T细胞受体（T cell receptor, TCR）识别磷酸化抗原，并分泌穿孔素和颗粒酶直接杀伤肿瘤细胞，同时释放干扰素-γ（interferon-γ, IFN-γ）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）等促炎细胞因子重塑TME。然而，γδT细胞在体内的归巢效率和持续性有限，且缺乏针对特定肿瘤抗原的特异性靶向能力。因此，如何将BiTE的精准靶向优势与γδT细胞的固有抗肿瘤特性相结合，成为破解实体瘤免疫治疗瓶颈的关键科学问题。本研究正是基于这一背景，提出利用靶向前列腺特异性膜抗原（prostate-specific membrane antigen, PSMA）的BiTE分子重定向γδT细胞，以实现对PCa的高效、特异性杀伤。

二、主要技术方法

1. 1.
   双特异性抗体设计与表达：采用基因工程方法构建编码抗PSMA单链可变区片段（single-chain variable fragment, scFv）和抗CD3 scFv的融合基因，通过哺乳动物细胞表达系统（如CHO细胞）生产并纯化PSMA×CD3 BiTE蛋白。经SDS-PAGE和尺寸排阻色谱（size-exclusion chromatography, SEC）验证其纯度及正确二聚化结构。
2. 2.
   γδT细胞体外扩增：从健康供体外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell, PBMC）中分离γδT细胞，使用唑来膦酸（zoledronic acid）和白介素-2（interleukin-2, IL-2）刺激扩增14天，通过流式细胞术（flow cytometry）检测Vγ9Vδ2 T细胞纯度（>90%）。
3. 3.
   体外细胞毒性实验：以PSMA阳性PCa细胞系（如LNCaP、22Rv1）为靶细胞，PSMA阴性细胞系（如DU145）为对照，按不同效应细胞/靶细胞比例（E:T ratio）共培养，加入梯度浓度BiTE后通过乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）释放法或钙黄绿素-AM（Calcein-AM）标记法测定杀伤效率。
4. 4.
   免疫表型与功能分析：采用多色流式细胞术检测γδT细胞表面活化标志物（CD69、CD25）、耗竭标志物（PD-1）及胞内IFN-γ和TNF-α的表达水平；通过酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）定量培养上清中的细胞因子浓度。

三、研究结果

1. PSMA×CD3 BiTE成功表达并保持双价结合活性

研究人员通过Western blot和流式细胞术证实，纯化的BiTE蛋白可同时结合PSMA重组蛋白和CD3阳性的Jurkat T细胞。表面等离子共振（surface plasmon resonance, SPR）分析显示其对PSMA和CD3的解离常数（K_D）分别为12.3 nM和8.7 nM，表明高亲和力。

2. BiTE以PSMA依赖方式增强γδT细胞对PCa细胞的杀伤

在共培养体系中，添加100 pM BiTE后，γδT细胞对LNCaP细胞的裂解率从15%显著提升至72%（E:T=10:1），而对PSMA阴性的DU145细胞无明显增强作用。LDH释放实验进一步证实该效应依赖于BiTE浓度，半数最大效应浓度（EC₅₀）约为25 pM。

3. BiTE促进γδT细胞活化和细胞因子分泌

流式细胞术结果显示，与BiTE共孵育24小时后，γδT细胞中CD69阳性率由基线18%升至65%，CD25阳性率由5%升至32%。ELISA检测发现，上清中IFN-γ浓度从对照组的120 pg/mL跃升至1800 pg/mL，TNF-α也同步升高，但IL-10和TGF-β水平未发生显著变化。

4. 联合处理不影响γδT细胞耗竭标志物表达

与单独BiTE或单独γδT细胞处理相比，联合组中PD-1和TIM-3的表达水平均维持在较低水平（PD-1阳性率<10%），提示短期暴露于BiTE不会诱导γδT细胞的功能耗竭。

5. BiTE介导的细胞毒性与靶细胞PSMA表达水平正相关

研究人员比较了三种PSMA表达量不同的PCa细胞系（LNCaP高表达、22Rv1中表达、PC-3低表达），发现BiTE增效程度与靶细胞表面PSMA平均荧光强度（mean fluorescence intensity, MFI）呈线性关系（R2=0.94），证实了靶点特异性的剂量-效应关联。

四、讨论与结论

讨论总结：

本研究首次证实PSMA×CD3 BiTE能够有效重定向扩增的γδT细胞，实现对PSMA阳性PCa细胞的特异性杀伤，同时维持γδT细胞的活化状态而不诱发早期耗竭。该策略的优势在于：（1）BiTE提供的物理桥接作用弥补了γδT细胞天然缺乏肿瘤抗原特异性识别的缺陷；（2）γδT细胞固有的MHC非限制性机制使其不易被TME中的免疫逃逸机制所规避；（3）BiTE诱导的IFN-γ和TNF-α分泌有助于逆转局部免疫抑制，可能协同增强后续内源性抗肿瘤免疫应答。然而，研究也存在局限性：所有数据均来自体外实验，尚未在体内模型中验证疗效和安全性；扩增的γδT细胞来源于健康供体而非PCa患者，后者可能存在T细胞功能缺陷；此外，BiTE的半衰期短和潜在的细胞因子风暴风险仍需进一步优化。

研究结论：

研究人员得出结论，PSMA×CD3 BiTE联合扩增的Vγ9Vδ2 T细胞是一种具有临床应用潜力的新型过继细胞免疫治疗策略，能够以PSMA依赖的方式高效清除前列腺癌细胞，同时促进γδT细胞的活化和促炎细胞因子分泌。该联合方案为克服实体瘤免疫治疗的TME屏障提供了新思路，未来需通过异种移植小鼠模型和临床试验进一步评估其体内抗肿瘤效能及安全性。