《Stem Cell Research & Therapy》：Functional analysis of adrenocorticotropic-hormone–producing pituitary cells derived from human pluripotent stem cells in murine and primate models of hypopituitarism
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背景：垂体功能减退症的患病率约为每10万人口45.5例，并非罕见疾病。垂体功能减退症无法自行缓解，被认定为难治性疾病。特别是促肾上腺皮质激素（ACTH）缺乏可导致肾上腺功能不全及危及生命的危象。目前的标准治疗为激素替代疗法；然而，精确调整以匹配激素需求的生理变
背景：垂体功能减退症的患病率约为每10万人口45.5例，并非罕见疾病。垂体功能减退症无法自行缓解，被认定为难治性疾病。特别是促肾上腺皮质激素（ACTH）缺乏可导致肾上腺功能不全及危及生命的危象。目前的标准治疗为激素替代疗法；然而，精确调整以匹配激素需求的生理变化（如昼夜节律和应激反应）往往困难。因此，垂体功能减退症患者面临的猝死风险高于健康个体。研究人员的目标是生成能够响应环境信号的垂体激素产生细胞，从而提供一种具有生理响应性和安全性保障的新型疗法。
方法：研究人员此前建立了一种临床相关的方案，可从人 pluripotent stem cells（hPSCs）高效生成包含ACTH产生细胞的垂体-下丘脑类器官。为验证其作为垂体细胞制剂治疗用途的概念，研究人员将人胚胎干细胞来源的垂体-下丘脑类器官移植至垂体功能减退的重症联合免疫缺陷（SCID）小鼠皮下组织，并评估其效果。随后，研究人员构建了垂体功能减退的食蟹猴模型，并在适应自人临床胰岛移植方案的免疫抑制方案下进行垂体-下丘脑类器官的皮下移植。
结果：在小鼠中，移植的垂体-下丘脑类器官存活超过6个月，显著改善循环ACTH浓度，并延长了生存期（优于假手术组小鼠）。在食蟹猴中，移植的类器官功能持续6周，并提高了循环ACTH浓度。
结论：据研究人员所知，此前尚无在灵长类中的研究证明有效的垂体细胞移植，无论其来源为胎儿垂体、异种垂体或PSCs。未来的优先事项包括获取全面的非临床数据以指导首次人体临床试验设计；优化移植技术；评估免疫抑制及辅助治疗；以及评估安全性和有效性参数。与此同时，利用临床级诱导PSCs开发可扩展的生产平台，将对最终建立垂体细胞移植治疗的临床应用基础至关重要。
论文解读
一、研究背景与目的
垂体功能减退症（hypopituitarism）是一种患病率约为每10万人口45.5例的难治性疾病，患者因垂体激素缺乏而面临显著的健康风险。其中，促肾上腺皮质激素（adrenocorticotropic hormone，ACTH）缺乏可直接导致肾上腺功能不全，进而引发危及生命的肾上腺危象。目前的标准治疗是终身激素替代疗法，但精确匹配昼夜节律和应激反应等生理性激素需求变化极为困难，剂量不足可诱发肾上腺危象，过量则可能导致库欣综合征。即便接受标准激素替代治疗，患者仍面临高于健康人群的死亡风险。垂体组织一旦受损无法再生，因此利用多能干细胞（pluripotent stem cells，PSCs）体外分化生成垂体细胞并移植治疗，成为垂体再生医学的重要方向。研究人员此前已建立了从人PSCs（hPSCs）高效生成包含ACTH产生细胞的垂体-下丘脑类器官（pituitary–hypothalamus organoids）的临床相关方案，并在免疫缺陷小鼠肾包膜下移植中验证了治疗效果。为进一步推动临床转化，本研究旨在优化皮下移植方案，并在免疫健全的非人灵长类模型中评估异种移植的安全性和有效性。
二、研究内容与主要结论
研究人员首先在垂体功能减退的SCID小鼠中系统比较了三种皮下移植位点（腋窝皮下白色脂肪、腹股沟皮下白色脂肪和臀肌内）的疗效，并评估了bFGF血管生成预处理的短期效应。随后，研究人员构建了经口鼻蝶窦内镜手术切除垂体的食蟹猴垂体功能减退模型，在采用改良自临床人胰岛移植的埃德蒙顿免疫抑制方案（无类固醇）下，将1440个人胚胎干细胞来源的垂体-下丘脑类器官移植入猴背部皮下脂肪组织。结果显示，小鼠移植后6个月内血浆ACTH浓度显著高于假手术组，且各移植位点均能延长生存期；食蟹猴移植后至少6周内基础血浆ACTH和皮质醇浓度升高，体重下降趋势显著减缓。组织学检查确认了类器官在两种模型中的存活和ACTH表达，但猴移植部位出现淋巴细胞和组织细胞浸润，提示免疫排斥是限制移植物长期功能的主要因素。这是首次在非人灵长类中证明人PSC来源垂体细胞移植的功能有效性。
三、主要关键技术方法
本研究采用的核心技术方法包括：利用人胚胎干细胞系KhES-1（来源：日本RIKEN生物资源研究中心）经无饲养层培养和无血清化学限定培养基中的三维悬浮分化，生成包含下丘脑和垂体组织的垂体-下丘脑类器官；通过经听道抽吸法建立SCID小鼠垂体功能减退模型，并经CRH刺激试验确认ACTH缺乏；通过经口鼻蝶窦内镜手术建立食蟹猴垂体功能减退模型；采用皮下脂肪组织或肌肉内移植、bFGF缓释片（Duragen人工硬脑膜浸渍bFGF、肝素和透明质酸钠）血管生成预处理；采用埃德蒙顿方案（他克莫司、霉酚酸酯、依那西普和兔抗胸腺细胞球蛋白）进行免疫抑制；通过电化学发光免疫分析法（ECLIA）和ELISA检测血浆及培养上清ACTH浓度；通过免疫组织化学和免疫荧光染色评估移植物存活、增殖（Ki67）和免疫细胞浸润。
四、研究结果
- 1.
小鼠移植位点的六个月评估：研究人员将hESC来源的垂体-下丘脑类器官分别移植入腋窝皮下白色脂肪（n=5）、腹股沟皮下白色脂肪（n=6）和臀肌（n=6），并与假手术组（n=4）比较。移植前各组血浆ACTH浓度无显著差异；移植后6个月，所有移植组的基础和CRH刺激后血浆ACTH浓度均显著高于假手术组，三个移植位点间无显著差异。结果表明，无论具体移植位点如何，垂体-下丘脑类器官移植均能在6个月内维持ACTH分泌。
- 2.
皮下移植改善小鼠生存率：以垂体切除日为第0天，Kaplan–Meier生存分析显示，三个移植组（腋窝、腹股沟、肌肉）均比假手术组存活显著延长（log-rank检验，χ2=30.5，df=3，p<0.05）。
- 3.
小鼠皮下移植后的组织学发现：移植后3个月取移植物及周围组织进行H&E染色，证实类器官在白色脂肪或肌肉内成功存活；免疫荧光染色确认移植物内ACTH表达。Ki67染色显示，移植用类器官（第138天）和移植后3个月的移植物中仅残留极少量Ki67阳性细胞，6个月随访中未发现异常细胞增殖。
- 4.
食蟹猴移植后ACTH和体重变化：15岁雄性食蟹猴（体重6.22 kg）经垂体切除后确认垂体功能减退，尽管接受激素替代治疗，体重仍持续下降。在埃德蒙顿方案免疫抑制和bFGF预处理下，移植1440个类器官（体外ACTH分泌能力平均13,100 pg/mL）。移植后6周观察到基础ACTH和皮质醇浓度升高；移植前平均基础ACTH为1.5 pg/mL，移植后为6.33 pg/mL。分段回归模型显示，移植前体重每周下降?0.060 kg，移植后斜率变为+0.002 kg/周，体重下降趋势显著减缓（β?=0.062，SE 0.024，p<0.05），表明移植物在6周内具有功能活性。
- 5.
食蟹猴皮下移植部位的组织学特征：移植后3个月取移植物，H&E染色确认类器官在皮下组织中存活，免疫组化证实ACTH表达，并观察到移植物与宿主血管连接。主要器官（肺、肝）中未发现移植物来源的播散组织。然而，大多数移植类器官周围出现小淋巴细胞和组织细胞浸润，免疫组化显示CD68?巨噬细胞、CD3? T淋巴细胞和CD20? B淋巴细胞浸润，提示存在免疫介导的排斥反应。
五、讨论与结论总结
讨论部分指出，本研究首次在非人灵长类中证明人垂体细胞移植的功能有效性。研究采用了皮下移植（便于监测和必要时移除）、bFGF血管生成预处理（改善皮下缺血环境）和埃德蒙顿无类固醇免疫抑制方案（避免外源性类固醇干扰ACTH功能评估）三个预定策略。尽管观察到移植后ACTH和皮质醇升高及体重下降减缓，但异种免疫排斥（巨噬细胞、T细胞浸润）是限制移植物长期功能的主要因素。研究人员分析，排斥反应可能源于：埃德蒙顿方案并非针对猴异种移植优化；口服免疫抑制剂因猴食物摄入波动导致血药浓度不稳定。此外，猴皮下脂肪因术后体重下降而减少，导致移植床缺血，以及免疫抑制剂的潜在直接细胞毒性，均可能影响体内ACTH分泌水平。体外实验显示他克莫司和霉酚酸酯未显著降低类器官基础ACTH分泌，提示体内低分泌水平主要归因于移植环境的综合损伤而非类器官本身质量。研究局限性包括：小鼠中未检测皮质酮（对应人皮质醇的主要糖皮质激素）；猴实验为单一个案，体重分析结果受时间点选择影响；食蟹猴获取日益困难且成本高昂。研究结论：这是首次证明hESC来源的ACTH产生细胞移植入垂体功能减退非人灵长类模型后，既实现ACTH分泌功能改善又实现组织学存活的研究。未来研究应聚焦于优化移植技术和免疫抑制方案、确定合适细胞剂量，以及开发使用临床级诱导PSCs的可扩展生产平台，为垂体激素产生细胞再生疗法的临床应用奠定基础。
