靶向敲入 SLC12A3 基因修复 Gitelman 综合征患者来源肾脏类器官功能

《Stem Cell Research & Therapy》：CRISPR/Cas9-mediated SLC12A3 gene knock-in restores molecular and functional defects in Gitelman syndrome hiPSC-derived kidney organoids

摘要

背景

本研究旨在利用患者来源的人类诱导多能干细胞（hiPSCs）和肾脏类器官系统，通过将全长SLC12A3基因及其广泛存在的启动子敲入安全 harbor 位点，探究其是否能够恢复 Gitelman 综合征（GS）患者中 Na?–Cl? 共转运体（NCC）的表达和功能。

方法

从两名具有不同SLC12A3突变的患者的外周血液中获得了 GS1 和 GS2 hiPSCs。在 GS1 和 GS2 细胞系中，利用 CRISPR/Cas9 技术将SLC12A3基因敲入 AAVS1 安全 harbor 位点，生成了 GS1^SLC12A3?KI 和 GS2^{SLC12A3?KI hiPSCs。WTC-11（野生型）、GS1、GS2、GS1SLC12A3?KI、GS2SLC12A3?KI hiPSCs 被诱导分化为肾脏类器官。通过 qRT-PCR、免疫印迹和免疫荧光技术分析了 NCC 及相关激酶的表达情况。钠离子转运能力和噻嗪类药物的反应通过 CoroNa? Green 色素和流式细胞术进行了评估。}

结果

成功构建了 GS1 和 GS2 hiPSCs，在敲入SLC12A3基因后，这两种患者来源的 hiPSCs 中的SLC12A3基因表达得到恢复。与亲代细胞（分别为 GS1 和 GS2）相比，生成的 GS1^SLC12A3?KI 和 GS2^{SLC12A3?KI hiPSCs 的SLC12A3 mRNA 和 NCC 蛋白水平恢复正常。由 GS1SLC12A3?KI 和 GS2SLC12A3?KI hiPSCs 分化的肾脏类器官显示 NCC 在肾小管上皮中的定位得到恢复，WNK4–SPAK–OSR1 信号通路对血管紧张素 II 的响应得以恢复，噻嗪类药物诱导的钠离子转运能力也得以重现，而 GS1 和 GS2 的肾脏类器官则没有这些变化。}

结论

这些结果表明，靶向敲入SLC12A3基因可以修复 GS 患者来源的肾脏类器官中 NCC 的分子和功能缺陷，为在人体类器官模型中实现SLC12A3基因缺陷的功能矫正提供了概念验证。