β-羟基丁酸（BHB）在外源性葡萄糖剥夺下维持线粒体呼吸并支持反复扩散性去极化

《Cellular and Molecular Neurobiology》：β-Hydroxybutyrate Maintains Energetically Demanding Neural Functions During Exogenous Glucose Deprivation

　　

酮体（ketone bodies）在禁食和生酮饮食期间是脑能量的主要来源，但其在葡萄糖缺失时能否维持脑组织代谢仍不确定。该问题难以在体内（in vivo）解决，因为循环葡萄糖即使在饥饿期间也通过内源性生成维持。因此，研究人员使用离体脑制备（ex vivo brain preparation）检查组织在以β-羟基丁酸（β-hydroxybutyrate, BHB）作为唯一外源燃料孵育后的代谢能力，并将脑组织与其主要内源性葡萄糖来源隔离。研究人员在无葡萄糖、富含BHB的人工脑脊液（artificial cerebrospinal fluid, aCSF）中孵育4小时后监测线粒体呼吸，并通过诱导扩散性去极化（spreading depolarization, SD）检测组织韧性，SD是一种严重能量挑战，需要快速恢复离子和代谢稳态。在急性依赖外源BHB以及内源性能量储备后，线粒体电子传递系统（mitochondrial electron transfer system）功能持续存在，O₂通量低于外源葡萄糖孵育后。BHB支持的组织维持足够能量能力以产生并从反复SD中恢复。相反，仅依赖内源性能量储备的组织未能经历反复SD，提示在完全缺乏外源葡萄糖时，外源BHB提供了超出内源性底物可利用范围的短期能量支持。这些结果拓宽了对脑燃料灵活性的理解，并提供证据表明BHB可在外源葡萄糖缺失时支持高耗能神经功能。图形摘要：脑燃料灵活性：葡萄糖与酮体。在缺乏外源葡萄糖时，经β-羟基丁酸（BHB）孵育后线粒体呼吸持续存在，但O₂通量降低。BHB支持的脑片产生并从反复扩散性去极化（SD）中恢复，而仅依赖内源性能量储备的脑片不能维持反复SD。总之，这些发现表明，酮体支持的脑片可维持超出单独内源性燃料储备支持的高耗能神经功能。ADP，二磷酸腺苷（adenosine diphosphate）；ATP，三磷酸腺苷（adenosine triphosphate）；Cyt c，细胞色素c（cytochrome c）；TCA，三羧酸（tricarboxylic acid）。

哺乳动物脑传统上被视为葡萄糖依赖器官，能量需求高且能量储备有限。正常生理条件下，葡萄糖被认为是支持脑ATP产生的主要底物。然而，在长时间禁食、生酮饮食依从或其他碳水化合物可用性降低状态，循环酮体升高并成为脑的重要替代燃料，即酮症。β-羟基丁酸（β-hydroxybutyrate, BHB）是主要循环酮体，可穿过血脑屏障并被神经细胞氧化以支持线粒体能量产生。虽然酮体被广泛认为是葡萄糖节省底物，可在体内降低脑葡萄糖利用，但BHB能否在葡萄糖缺失时维持脑组织能量学仍不清楚。定义脑组织对葡萄糖剥夺的反应有助于理解治疗性酮症，尤其在耐药性癫痫和GLUT1缺陷综合征等疾病中。体内直接测试较困难，因为完整哺乳动物在长时间饥饿时通过糖异生维持葡萄糖，GLUT1缺陷综合征中葡萄糖转运只是降低而非消除，难以分离脑对葡萄糖与替代燃料的依赖。离体脑制备可将脑组织与系统性葡萄糖来源隔离，仅保留局部内源能量储备。研究人员因此量化以BHB为唯一外源能量底物孵育后脑组织线粒体呼吸，以及经历并恢复多次扩散性去极化（spreading depolarization, SD）的能力。SD被认为是脑内能量需求最高的事件之一。仅依赖内源能量储备的组织不能产生第二次SD，提示BHB提供超出剩余内源燃料底物的支持。BHB孵育4小时后线粒体O₂通量低于葡萄糖孵育。无外源葡萄糖时脑组织产生重复SD挑战了外源葡萄糖必要性的观点，并提供BHB作为替代脑燃料的证据。

关键技术方法：研究采用3–9周龄雄性和雌性C57BL/6小鼠（经IACUC批准）。制备400 μm水平脑切片并解剖为新皮质，随机分配至含10 mM葡萄糖、10 mM外消旋BHB或10 mM蔗糖的aCSF，蔗糖为无外源燃料对照。高分辨率呼吸测定使用Oroboros O2k，并以底物-解偶联剂-抑制剂滴定（substrate-uncoupler-inhibitor titration, SUIT）评估线粒体呼吸状态。SD以高K⁺ aCSF诱导，采用本征光学信号（intrinsic optical signal, IOS）成像，并用Python流程和SAM2.1分割进行SD识别与定量。统计使用GraphPad Prism，采用参数或非参数检验及Fisher精确检验等。样本来源为实验室C57BL/6小鼠。

研究结果：

外源性葡萄糖剥夺期间基础线粒体功能得以维持（Basal Mitochondrial Function is Maintained During Exogenous Glucose Deprivation）。研究人员将小鼠新皮质组织在含10 mM BHB、10 mM葡萄糖或10 mM蔗糖的aCSF中维持4小时后，以高分辨率呼吸测定评估线粒体呼吸功能。在所有检查的呼吸状态中，BHB孵育后的O₂通量（J_O2）均显著低于葡萄糖孵育后。复杂I连接的LEAK呼吸降低；ADP招募ATP合酶后，复杂I支持的和复杂I与II支持的氧化磷酸化（oxidative phosphorylation, OXPHOS）期间J_O2仍较低；最大非偶联电子传递（electron transfer, ET）能力在复杂I与II支持或仅复杂II支持时也较低。无外源燃料底物的蔗糖aCSF组依赖内源能量储备，其各耦合控制状态的线粒体J_O2较葡萄糖组进一步降低。这些数据表明，外源葡萄糖剥夺下线粒体呼吸可维持，但呼吸谱以各状态J_O2较低为特征。

BHB能为高耗能脑事件提供所需能量（BHB Can Supply the Energy Required for Highly Energetically Demanding Brain Events）。研究人员将新皮质脑片在葡萄糖、BHB或蔗糖aCSF中孵育后，以高K⁺浴诱导SD。蔗糖组作为无葡萄糖或无BHB对照，用于考虑内源能量储备贡献。三组所有切片均发生第一次SD；然而只有BHB和葡萄糖组能够发生并从第二次SD恢复。第一次高K⁺周期中，SD潜伏期和传播速度在各组间无显著差异。第二次SD诱导后，BHB处理切片较葡萄糖处理切片显示显著更长的潜伏期和更慢的SD传播速率。IOS分析显示所有处理组在第一次SD后回到基线反射，与SD相关细胞肿胀逆转一致。ΔR/R₀峰值幅度在BHB和蔗糖孵育切片中均显著低于葡萄糖孵育切片；从峰值幅度恢复50%的时间（T₅₀）各组无差异。使用2 mM BHB的额外高K⁺浴实验中，大多数切片产生初始SD，一部分保留支持第二次SD能力，传播速度有差异但潜伏期事后比较无显著差异。总体，这些数据表明BHB可在无外源葡萄糖时支持诱导和从反复SD恢复，超出仅内源能量储备支持的能力。

讨论部分总结：讨论指出，葡萄糖经典上被视为神经组织必需能量底物，但神经元表现代谢灵活性，可利用乳酸、酮体、脂质等多种底物，摄取主要由葡萄糖转运体（GLUTs）和单羧酸转运体（MCTs）促进。本研究检查BHB能否在外源葡萄糖剥夺期间支持脑组织代谢，超出单独内源储备。BHB孵育后高分辨率呼吸测定所有呼吸状态线粒体J_O2较葡萄糖孵育组织降低；尽管如此，BHB支持组织能产生并恢复反复SD。重复SD诱导还显示BHB处理组织较葡萄糖处理组织SD潜伏期延长、传播减慢。这些发现提示BHB可在无外源葡萄糖数小时维持脑功能，并可能降低组织对重复SD的易感性。BHB后线粒体J_O2降低与线粒体漏呼吸、OXPHOS能力和ET能力降低有关。无外源燃料底物孵育组织各耦合控制状态J_O2仍更低，表明单独内源储备也可维持可测线粒体呼吸。不同分解代谢底物可因耦合效率、质子漏、ATP/O₂化学计量和ATP水解热力学状态差异，以不同呼吸速率支持相似功率输出。酮体代谢曾被提出通过增加线粒体耦合效率和ATP通量、增加ΔG_ATP、减少自由基损伤、提高高能量需求下生物能量韧性改变线粒体生物能量学，但本研究未测试这些效应。BHB孵育后较低线粒体J_O2可能反映更有效代谢策略，也可能反映ATP生成能力降低；潜在机制包括线粒体适应降低能量需求，因为酮体可降低神经元兴奋性，或BHB对线粒体呼吸能力的急性抑制效应。SD被选为极端能量需求的短暂可重复模型，因为跨膜离子梯度严重破坏需要大量ATP依赖离子转运恢复离子稳态。无外源燃料的蔗糖条件切片产生一次SD，表明内源能量储备足以支持初始能量挑战；但这些切片不能产生第二次SD，而外源葡萄糖或BHB供应切片产生并恢复反复SD。鉴于从SD恢复代表脑组织遇到的最重要能量挑战之一，这些发现表明BHB提供超出单独内源能量储备维持的代谢支持。第一次高K⁺刺激至SD诱导的初始潜伏期和SD波前平均传播速度在葡萄糖和BHB处理切片间相似；对重复SD，BHB处理组织显示SD起始潜伏期延长和平均SD传播减慢。SD传播依赖SD波前将相邻神经元招募至再生波；因此潜伏期增加和传播速度降低通常被解释为SD易感性降低标志。因为能量剥夺是常见SD诱导范式，BHB对SD动力学影响可能由这些极端脑扰动期间能量可用性改变和/或直接调节神经元离子通道引起。一个显著研究局限是使用Na-BHB，较葡萄糖aCSF轻度增加细胞外Na⁺浓度。虽然溶液渗透压相似且额外Na⁺预测电生理效应小，但未包含反离子匹配对照；因此不能排除Na⁺依赖贡献。其他局限包括样本量有限、未盲法、IOS分割自动化后手动校正可能观察者偏倚、使用外消旋BHB、底物浓度不直接复制体内环境、离体制备不复制血管、激素、转运和系统适应，且未直接检测组织活力。

结论翻译：总体而言，这些数据表明，β-羟基丁酸可在短期缺乏外源葡萄糖时支持高耗能神经活动，其评估通过诱导反复扩散性去极化进行，提示显著的脑代谢灵活性。本研究未直接检测组织活力；因此，未来研究应确定长期依赖BHB如何影响能量产生之外的过程，包括生物合成途径、超出急性谷胱甘肽氧化还原评估的氧化还原稳态以及整体组织健康。