《Egyptian Liver Journal》：Mechanism study of STOML2 regulating hepatocellular carcinoma cell proliferation, invasion, and migration by activating the PI3K/AKT signaling pathway
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目的：探讨STOML2在肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）mRNA、蛋白及亚细胞定位水平的表达特征，阐明其与免疫微环境、单细胞表达谱、耐药和预后的相关性，并验证其通过PI3K/AKT信号通路调控HCC细胞增殖、侵袭、迁移和凋
目的：探讨STOML2在肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）mRNA、蛋白及亚细胞定位水平的表达特征，阐明其与免疫微环境、单细胞表达谱、耐药和预后的相关性，并验证其通过PI3K/AKT信号通路调控HCC细胞增殖、侵袭、迁移和凋亡的生物学功能及机制。方法：使用TCGA、CPTAC、HPA、TIMER2.0、TISCH和GEPIA2数据库进行生物信息学分析，探讨STOML2表达、预后、免疫浸润、单细胞分布及相关信号通路。选择STOML2高表达的HCCLM3细胞构建siRNA介导的敲低模型。采用CCK-8、Transwell、划痕实验、流式细胞术和Western blot检测细胞表型和通路蛋白变化。结果：STOML2在HCC组织中mRNA和蛋白水平显著上调；HPA分析显示HCC中呈强阳性染色，正常肝组织呈中等表达。配对样本分析证实HCC中STOML2表达显著高于癌旁非癌组织（P < 0.001）。高STOML2表达预测总生存期较短（HR = 1.67, P < 0.05），并对1年生存显示中等预后价值（AUC = 0.690）。单细胞水平上，STOML2主要富集于恶性HCC细胞，并与肿瘤相关免疫细胞浸润及PD-L1、CTLA-4、LAG3表达正相关。其亦与HIF1A、SLC7A11和AKT1正相关，提示在索拉非尼耐药中发挥作用。GSEA和相关性分析验证STOML2与PI3K/AKT通路密切关联。体外实验显示，STOML2敲低显著抑制增殖、侵袭和迁移，促进凋亡，并降低p?PI3K和p?AKT水平，而不改变总PI3K和AKT。结论：STOML2在HCC中高表达，并与不良预后、免疫抑制微环境和潜在耐药相关。STOML2通过激活PI3K/AKT信号通路促进HCC进展，可能作为HCC有前景的预后生物标志物和治疗靶点。
肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）在全球发病率和死亡率均居前列，具有高侵袭性和高复发率，多数患者确诊时已处晚期，治疗结局差、预后不良。因此，深入探究HCC发生发展的关键分子机制，发现新的诊断生物标志物和治疗靶点，对改善患者临床结局具有重要意义。STOML2是一种定位于线粒体或细胞膜的支架蛋白，已在多种恶性肿瘤中显示异常过表达，并与肿瘤进展和患者不良预后密切相关。近期研究提示，STOML2可通过激活Wnt/β-catenin通路或调节自噬促进结直肠癌、胃癌等胃肠道肿瘤进展，提示其致癌作用具有多通路、多肿瘤特征。也有研究发现STOML2可能参与HCC发生发展。PI3K/AKT信号通路是HCC起始和进展的核心驱动之一，其异常激活可通过调控增殖、凋亡、迁移、侵袭、代谢重编程及免疫微环境重塑等下游关键生物学过程推动恶性进展。基于此，研究人员通过公共数据库分析和体外细胞实验，系统研究STOML2在HCC中的表达和功能，验证其与PI3K/AKT信号通路的关联，为HCC靶向治疗提供实验证据。
关键技术方法概述：公共数据来源包括TCGA-LIHC（374例HCC和50例正常肝组织；50对HCC与癌旁非癌组织用于配对差异分析）、CPTAC（经UALCAN平台）、HPA、TIMER2.0、ImmuCellAI、GEPIA2和TISCH；GSEA 4.3.2以KEGG基因集分析高STOML2表达组富集通路，设置1000次表型置换，基因集大小15–500，计算NES和FDR。细胞系筛选整合CCLE和GEO数据，选择STOML2高表达的HCCLM3。采用siRNA瞬转构建STOML2敲低模型，设Blank、siNC和siSTOML2组，以qRT-PCR和Western blot验证。表型检测采用CCK-8、Transwell、划痕实验、流式Annexin V-FITC/PI凋亡检测；Western blot检测PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT和β-actin。统计使用R 4.3.0，Mann-Whitney U检验、Kaplan-Meier法、log-rank检验、时间依赖ROC、ANOVA及Tukey HSD检验。
研究结果如下。
STOML2在肝细胞癌组织中显著上调。TCGA-LIHC分析显示，STOML2 mRNA表达log
2(TPM + 1)在HCC肿瘤组织中显著高于正常肝组织（P < 0.001），肿瘤组织中位表达约7.0，正常组织约6.3，且肿瘤组织异质性更大。HPA免疫组化显示，正常肝细胞中STOML2呈中等细胞质和细胞膜表达，而HCC组织中呈强阳性表达。CPTAC蛋白质组学进一步验证，STOML2蛋白在HCC中显著高于正常肝组织（P < 0.05）。这些结果一致表明STOML2在HCC的mRNA和蛋白水平均显著上调。
STOML2表达与HCC患者预后相关。生存分析显示，高STOML2表达是HCC患者不良预后的潜在危险因素。TCGA-LIHC队列Kaplan-Meier分析表明，高STOML2 mRNA表达组总生存期显著短于低表达组（正文结果报告HR = 10.74，95% CI 6.06–19.02，P < 0.0001；摘要报告HR = 1.67，P < 0.05）。时间依赖ROC分析显示，STOML2预测1年生存的AUC = 0.690。结果提示高STOML2表达与HCC患者较差临床结局相关，并具有一定预后预测价值。
GSEA信号通路富集分析结果。对TCGA-LIHC数据进行GSEA，高STOML2表达表型显著富集于Wnt、MAPK和PI3K-Akt等肿瘤进展相关信号通路。其中PI3K-Akt信号通路富集最高，NES = 1.733，adjusted P < 0.001，提示STOML2与该通路关联最密切。生物信息学预测提示STOML2可能通过调控PI3K/AKT信号通路影响HCC恶性生物学行为，为后续体外机制验证提供方向。
STOML2与HCC免疫微环境、单细胞表达及耐药相关。TIMER2.0和GEPIA2数据库显示，STOML2表达与髓样树突状细胞、B细胞、MAIT细胞和巨噬细胞浸润正相关（P < 0.05）。STOML2表达还与免疫检查点分子PD-L1、CTLA-4和LAG3显著正相关（P < 0.05），提示其可能促进HCC免疫抑制微环境形成。基于TISCH数据库的单细胞分析显示，STOML2主要在恶性肝细胞中高表达，在免疫细胞和基质细胞中表达较低。GEPIA2分析显示，STOML2表达与HIF1A、SLC7A11和AKT1正相关（P < 0.001），提示STOML2与索拉非尼耐药可能存在联系。
STOML2在高转移HCC细胞系HCCLM3中显著过表达。整合CCLE和GEO数据评估不同HCC细胞系中STOML2表达，发现高转移细胞系HCCLM3的STOML2 mRNA表达最突出，显著高于HLF和JHH1等其他常见HCC细胞系。该结果提示STOML2异常高表达可能与高转移表型相关，因此研究人员选择HCCLM3进行后续STOML2功能缺失实验。
STOML2敲低细胞模型成功构建。qRT-PCR显示，siSTOML2组STOML2 mRNA表达较Blank和siNC组降低约83%（P < 0.001）；Western blot显示siSTOML2组STOML2蛋白表达显著降低。结果说明STOML2敲低HCC细胞模型成功建立，可用于后续功能和机制研究。
敲低STOML2显著抑制HCC细胞增殖。CCK-8实验显示，与Blank和siNC组相比，siSTOML2组在各时间点增殖活性均显著受抑制，该抑制作用呈时间依赖性，并在培养72 h后最明显。
敲低STOML2显著抑制HCC细胞侵袭和迁移能力。Transwell侵袭实验显示，siSTOML2组穿过膜的细胞数较Blank和siNC组显著减少，侵袭能力明显受抑。划痕实验显示，siSTOML2组划痕愈合率显著低于两对照组，迁移速度显著降低。结果证实STOML2在调控HCC细胞侵袭和迁移中发挥关键作用。
敲低STOML2对HCC细胞凋亡的影响。流式细胞术Annexin V-FITC/PI双染结果显示，STOML2敲低显著诱导HCCLM3细胞凋亡。Quantitative分析显示，siSTOML2组早期凋亡细胞比例显著增加，晚期凋亡细胞比例显著高于对照组，总凋亡率显著增加（P < 0.05），活细胞比例显著降低；Blank与siNC组间无统计学差异。结果提示STOML2对维持HCC细胞存活具有重要作用。
敲低STOML2对PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达的影响。Western blot显示，STOML2敲低后p-PI3K和p-AKT蛋白表达显著降低，而总PI3K和总AKT表达保持不变（P < 0.05）；Blank组和siNC组各蛋白表达无显著差异（P > 0.05）。结果提示STOML2可能通过调节PI3K/AKT通路的磷酸化激活状态影响HCC细胞行为。
讨论部分总结：该研究确认STOML2在HCC组织中mRNA和蛋白水平显著过表达，并经配对样本分析和HPA免疫组化验证，且与患者不良预后相关，提示其可能是HCC进展的关键调节因子。这一发现与STOML2在非小细胞肺癌和乳腺癌等其他肿瘤中的致癌作用一致。GSEA发现高STOML2表达样本显著富集于PI3K/AKT信号通路；实验验证显示STOML2敲低抑制HCC细胞增殖、侵袭和迁移并诱导凋亡，同时下调p-PI3K和p-AKT，而不改变总蛋白水平，提示STOML2可能通过调控PI3K/AKT通路磷酸化激活状态影响HCC细胞行为。此外，STOML2与免疫细胞浸润和免疫检查点分子表达相关，单细胞分析显示其主要在恶性肝细胞表达，提示其可能参与重塑免疫抑制肿瘤微环境。其与耐药相关基因的相关性提示与索拉非尼耐药可能存在联系，但该部分仅为生物信息学假设，仍需进一步实验验证。与既往研究相比，该研究系统揭示STOML2通过PI3K/AKT通路调控HCC恶性细胞表型的机制，为理解HCC进展提供新分子视角。但STOML2如何精确调控PI3K/AKT通路上游或下游分子，以及是否与MAPK或Wnt等通路交互，仍需进一步研究。HCCLM3细胞模型结果尚未在体内验证，后续将利用裸鼠异种移植模型评估STOML2敲低效应。HCCLM3因在检测细胞系中STOML2表达最高而被选择，适合功能缺失研究，但单一高转移细胞系结果可能不能完全代表所有HCC亚型，未来需在更多细胞系和体内模型中推广结论。近年来靶向PI3K/AKT通路的小分子抑制剂在临床试验中显示潜力，STOML2作为上游调控因子可能成为联合治疗潜在靶点。总之，STOML2可能作为HCC新型预后生物标志物和潜在治疗靶点，靶向STOML2-PI3K/AKT轴为HCC治疗提供新策略。
研究结论翻译：STOML2在HCC中高表达，并与不良预后、免疫抑制微环境和潜在耐药相关。STOML2通过激活PI3K/AKT信号通路促进HCC进展，可能作为HCC有前景的预后生物标志物和治疗靶点。
