甲基丁香酚通过Ptn/Sdc4调控内皮细胞与Schwann细胞通讯增强神经微循环促进神经修复

《Natural Products and Bioprospecting》：Methyl eugenol increases neural microcirculation to promote nerve repair by regulating endothelial cell and Schwann cell communication via Ptn/Sdc4

　　

神经微循环（neural microcirculation）障碍常伴随神经损伤。改善神经微循环可促进受损神经修复。甲基丁香酚（methyl eugenol）是 Asarum heterotropoides 的主要生物活性成分，已有报道其在慢性疼痛中发挥镇痛作用。本研究旨在证明甲基丁香酚可增强神经微循环，从而促进神经修复。单细胞测序（single-cell sequencing）与mRNA测序（mRNA sequencing）联合分析显示，pleiotrophin（Ptn）/syndecan-4（Sdc4）对内皮细胞与Schwann细胞之间的耦联至关重要。研究人员将32只大鼠随机分为四组，即Sham、慢性压迫性损伤（chronic constriction injury，CCI）7d、CCI 14d和CCI 21d组，以评估CCI后内皮细胞–Schwann细胞通讯是否减弱。建立内皮细胞–Schwann细胞共培养体系后，给予甲基丁香酚、Ptn siRNA和Sdc4 siRNA（小干扰RNA，small interfering RNA，siRNA）。在另一项实验中，32只SD大鼠随机分为四个实验组：Sham、CCI、ibuprofen（布洛芬）和甲基丁香酚组。CellChat分析显示，神经损伤降低内皮细胞与Schwann细胞之间的通讯程度，尤其是通过Ptn/Sdc4的通讯。CCI破坏神经微循环，降低Ptn水平并增加Sdc4表达。在细胞实验中，甲基丁香酚促进大鼠主动脉内皮细胞（rat aortic endothelial cells，RAOECs）管形成并增加Ptn释放，Ptn作用于大鼠Schwann细胞（RSC96）中的Sdc4以促进迁移，但在缺乏内皮细胞来源因子的情况下不直接促进RSC96细胞迁移。甲基丁香酚治疗增加CCI大鼠的神经微循环，从而促进神经修复。此外，甲基丁香酚进一步增加Ptn水平。CCI导致神经微循环功能障碍和神经损伤。甲基丁香酚通过Ptn/Sdc4调控内皮细胞与Schwann细胞通讯，增强神经微循环，从而促进神经修复。

研究背景：坐骨神经痛（sciatica）是腰骶神经根受压迫或炎症导致沿坐骨神经（sciatic nerve）放射的下肢痛，年发生率为1–5%，终生患病率为13–40%。标准一线治疗为保守治疗，包括非甾体抗炎药（nonsteroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs），但镇痛有限，并常伴头晕、嗜睡、镇静、过敏反应以及肝或胃肠问题。手术等侵入性治疗与药物治疗四年以上随访无显著差异；保守治疗对坐骨神经痛似乎也不比安慰剂更有效。因此，迫切需要治疗坐骨神经痛的新药。神经损伤可导致坐骨神经痛，研究人员前期研究提示促进神经修复有助于缓解坐骨神经痛。长距离周围神经损伤中，Schwann细胞（Schwann cells，SCs）移植可增强结构和功能恢复；自体Schwann细胞移植可促进7.5 cm和5 cm间隙坐骨神经损伤修复。Schwann细胞迁移在周围神经修复中受血管内皮细胞（endothelial cells，ECs）导向，提示血管生成与神经再生密切相关。血管重建在神经再生中发挥关键作用，但改善神经微循环（neural microcirculation）与增强神经修复之间的联系尚不清楚。Asarum heterotropoides F. Schmidt传统用于炎症性疾病、牙痛、头痛、局部麻醉及其他疼痛；甲基丁香酚（methyl eugenol）被认为是Asarum的关键生物活性化合物，可用于区分不同Asarum种，并显示出局部麻醉和镇痛潜力，但其对神经修复的作用不清楚。研究人员通过mRNA测序（mRNA sequencing）和单细胞测序（single-cell sequencing）发现，pleiotrophin（Ptn）/syndecan-4（Sdc4）参与内皮细胞与Schwann细胞通讯。基于此，研究人员开展本研究，发现慢性压迫性损伤（chronic constriction injury，CCI）后内皮细胞–Schwann细胞通讯减弱，甲基丁香酚可增强神经微循环并通过Ptn/Sdc4促进神经修复。该研究提示甲基丁香酚具有促进神经修复的潜力，并在机制上连接了血管与Schwann细胞通讯。

主要关键技术方法：研究人员使用64只雄性Sprague–Dawley大鼠（8–9周龄，200–250 g，购自Guangzhou Weitong Lihua Biological Co., Ltd.），并利用研究人员前期发表的大鼠坐骨神经mRNA测序数据及公共单细胞测序数据集GSE146958。关键技术包括单细胞测序与mRNA测序联合分析、KEGG/GSEA、Seurat/Harmony、UMAP/t-SNE和CellChat细胞通讯分析，以|log₂FC|≥0.5和P<0.05为阈值；建立CCI大鼠模型并随机分组；采用Von Frey测试和坐骨神经血流检测；建立大鼠主动脉内皮细胞（rat aortic endothelial cells，RAOECs）与大鼠Schwann细胞RSC96共培养及条件培养基体系，使用Ptn siRNA和Sdc4 siRNA干预；结合管形成、划痕、CCK-8、H&E、免疫组化、ELISA、Western blot和双免疫荧光。

研究结果：
3.1 坐骨神经的单细胞测序与mRNA分析：通过KEGG和GSEA分析发现，坐骨神经损伤后“ECM–receptor interaction”和“cytokine–cytokine receptor interaction”通路显著富集；t-SNE/UMAP聚类显示，Sham组含较多内皮细胞（22.8%）和Schwann细胞（19.3%），CCI组分别降至10.6%和9.9%，提示损伤伴随巨噬细胞浸润增加以及Schwann和内皮细胞比例减少。
3.2 损伤降低内皮细胞与Schwann细胞之间的通讯：通过构建细胞通讯网络和CellChat分析，发现CCI后Schwann细胞与内皮细胞相互作用数量和强度降低；鉴定出Ptn/Sdc4和Ptn/Ncl通路，Ptn/Sdc4相互作用评分高于Ptn/Ncl；Sham组内皮细胞Ptn表达较高，损伤后降低。
3.3 CCI加重坐骨神经微循环障碍：通过坐骨神经血流检测、ELISA和Western blot，发现CCI术后7、14、21天微循环降低，TNF-α、IL-1β、TGF-β、IL-6、COX-2、IL-8升高；CCI增加Sdc4并降低Ptn。
3.4 CCI增加VEGF-A、Sdc4、IL-1β、COX-2、iNOS和nNOS水平：通过免疫组化发现，CCI组VEGF-A、Sdc4、IL-1β、COX-2、iNOS、nNOS水平升高，而Ptn表达降低。
3.5 甲基丁香酚促进RAOECs血管生成和Ptn分泌：通过CCK-8发现20 μM甲基丁香酚增加RAOEC活力；Ptn siRNA（50 nM）降低Ptn水平；二者不抑制RAOEC迁移；管形成实验显示甲基丁香酚增加分支点和总段长，增强血管网络形成，而Ptn siRNA降低这些参数。
3.6 Ptn促进Schwann细胞迁移：通过Sdc4 siRNA和划痕实验发现，Sdc4 siRNA（50 nM）降低Sdc4并抑制RSC96迁移；甲基丁香酚不增强RSC96迁移；RAOEC条件培养基增加RSC96迁移，Sdc4 siRNA转染后无明显变化；甲基丁香酚处理的RAOEC条件培养基增加RSC96迁移，而Ptn siRNA或Sdc4 siRNA逆转该效应。
3.7 甲基丁香酚促进神经微循环以缓解疼痛：通过血流分析、Von Frey、ELISA和H&E发现，CCI降低坐骨神经微循环，甲基丁香酚增加血流并缓解机械性异常性疼痛；甲基丁香酚抑制TNF-α、IL-1β、TGF-β、IL-6、COX-2、IL-8炎症反应；CCI导致坐骨神经结构紊乱、水肿和炎症细胞浸润，甲基丁香酚改善病理并减少炎症，且肝、肾H&E未见显著组织病理改变。
3.8 甲基丁香酚治疗后的Western blot分析和免疫组化染色：通过Western blot和免疫组化发现，CCI组cleaved caspase-3、caspase-3、COX-2升高，iNOS、nNOS、IL-1β、COX-2升高，MBP免疫反应降低，Ptn降低而Sdc4升高；ibuprofen和甲基丁香酚降低cleaved caspase-3、caspase-3、COX-2，下调iNOS、nNOS、IL-1β、COX-2，增加MBP，并使Ptn升高、Sdc4降低。
3.9 坐骨神经中Ptn和Sdc4的双免疫荧光染色：通过双免疫荧光和线轮廓分析发现，Sham组Ptn与Sdc4中等表达且部分重叠；CCI组Ptn荧光降低、Sdc4增加、空间重叠减少；甲基丁香酚明显增加Ptn并降低Sdc4，ibuprofen效果中等；CCI后Ptn与Sdc4信号失衡，甲基丁香酚可部分恢复，与Ptn/Sdc4介导的内皮–Schwann细胞通讯破坏和恢复一致。

讨论部分总结：讨论指出，甲基丁香酚改善神经微循环并通过Ptn/Sdc4调控内皮细胞–Schwann细胞（EC–SC）通讯促进神经修复。主要结论为：联合分析发现神经损伤降低内皮细胞与Schwann细胞通讯，尤其Ptn/Sdc4；神经损伤导致神经微循环障碍和神经炎症；甲基丁香酚促进RAOEC管形成并增加Ptn释放，Ptn作用于RSC96中Sdc4增强迁移；CCI大鼠中甲基丁香酚改善神经微循环并通过Ptn/Sdc4促进修复。血管重建对神经修复重要，血管化移植物等策略有前景；本研究中CCI降低血流，甲基丁香酚增加血流。Schwann细胞迁移对神经修复重要，移植具有治疗潜力；前期研究提示促进神经修复可通过抑制Schwann细胞凋亡缓解疼痛。损伤后Schwann细胞活化、去分化并形成引导轴突的Büngner带。CCI后凋亡增加，甲基丁香酚治疗后cleaved caspase-3、caspase-3和COX-2降低。神经与血管常平行，内皮细胞引导Büngner带形成以支持轴突再生；单细胞数据提示Ptn/Sdc4是关键。甲基丁香酚不促进RSC96迁移，但刺激RAOEC管形成，增加Ptn分泌，作用于RSC96的Sdc4促迁移，表明其通过内皮细胞依赖机制发挥作用。RAOECs不能完全代表神经微血管内皮细胞，但保留血管生成和旁分泌信号等关键内皮特征；未来需原代神经微血管内皮细胞验证。肝肾H&E未见明显异常。研究提示Ptn/Sdc4介导Schwann细胞–内皮细胞通讯，甲基丁香酚增强该串扰，增强神经微循环和神经修复。局限性包括仅用雄性大鼠、仅评估单一剂量、ibuprofen作为阳性对照；外推至其他物种和人类需谨慎，Ptn与Sdc4进化保守，但内皮和Schwann细胞生物学、药物代谢及免疫反应存在种属差异；需原代人细胞（微血管内皮和人Schwann细胞）、其他神经损伤模型（crush、transection）、两性、老龄动物、合并症（如糖尿病）以及药代和毒理研究验证。

结论翻译：CCI破坏神经微循环并诱导神经损伤。在细胞共培养实验中，甲基丁香酚促进RAOEC管形成并增加Ptn释放，作用于RSC96细胞中的Sdc4以增强迁移。在CCI大鼠中，甲基丁香酚改善神经微循环并增强神经修复，可能通过调节内皮–Schwann细胞通讯实现。