proNGF/NGF比值动态平衡经TrkA/p75NTR/Sortilin信号轴调控辽宁绒山羊毛囊周期转换的分子机制

《Frontiers in Cell and Developmental Biology》：Molecular mechanism of dynamic regulation of the proNGF/NGF ratio in controlling hair follicle cycle transition in liaoning cashmere goats

背景：神经生长因子（NGF）及其前体proNGF通过不同受体系统——TrkA与p75^NTR/Sortilin——在细胞增殖和凋亡中发挥相反的生物学功能。本研究旨在探究proNGF与NGF相对比值的动态变化是否通过TrkA/p75^NTR信号轴的动态平衡调控辽宁绒山羊（Capra hircus）毛囊周期转换，并阐明其潜在分子机制。方法：采集辽宁绒山羊休止期（3月）、生长期（9月）和退行期（1月）皮肤样本。采用苏木精-伊红（H&E）染色检查毛囊组织学结构。采用定量实时PCR（qRT-PCR）和蛋白免疫印迹（Western blotting）评估不同毛囊周期阶段NGF、proNGF、TrkA、p75^NTR和Sortilin的mRNA与蛋白表达水平。体外以大鼠毛囊干细胞（rHFSCs）和人真皮乳头细胞（hDPCs）作为细胞模型，进行11种不同处理，包括单独NGF、单独proNGF、不同proNGF/NGF比值的联合处理，以及TrkA抑制剂K252a干预。采用CCK-8（细胞计数试剂盒-8）法和流式细胞术评估细胞增殖和凋亡。选择差异比值组（对照组、高比值组和低比值组）进行转录组测序，分析差异表达基因（DEGs）及其富集信号通路。结果：H&E染色显示生长期次级毛囊活性最高。qRT-PCR和Western blot分析表明，NGF和TrkA表达水平在生长期显著升高（P < 0.05），而proNGF、p75^NTR和Sortilin在退行期表达显著增加（P < 0.05）。proNGF/NGF蛋白表达比值在生长期最低（0.56），退行期最高（1.89），休止期居中（1.56）。CCK-8法结果表明，单独NGF处理显著促进rHFSCs和hDPCs增殖（P < 0.05），该效应被K252a完全消除；单独proNGF处理对增殖无显著影响。在proNGF/NGF比值为1.56和1.89时，细胞增殖率显著低于单独NGF组（P < 0.05），而在比值为0.56时，增殖率与单独NGF组无显著差异，但显著高于对照组。流式细胞术证实，单独proNGF处理和高proNGF/NGF比值（1.56和1.89）显著诱导凋亡。转录组测序显示，与低比值组（0.56）相比，高比值组（proNGF/NGF = 1.89）的DEGs显著富集于“凋亡过程调节”和“类固醇激素生物合成”相关通路，抗凋亡分子Faim2和Naip5显著下调。结论：proNGF/NGF比值的动态变化是调控绒山羊毛囊周期转换的关键分子决定因素。生长期NGF/TrkA促存活信号占优势，驱动毛囊生长；相反，退行期proNGF/p75^NTR/Sortilin促凋亡系统占优势，诱导毛囊退化。proNGF/NGF比值可作为毛囊周期状态的新型分子生物标志物。靶向该平衡可能为调控绒山羊羊绒生长和治疗人毛囊相关疾病提供新的治疗策略。

研究背景与问题：神经生长因子（NGF）及其前体proNGF通过TrkA与p75^NTR/Sortilin两套受体系统在细胞增殖与凋亡中发挥相反作用。毛囊周期分为生长期、退行期和休止期，次级毛囊周期性再生直接决定绒山羊羊绒产量与品质。既往研究多关注NGF或proNGF单个分子的绝对表达，忽略两者相对比值；NGF和proNGF源于同一前体基因，翻译后加工效率决定二者比值，进而决定TrkA促存活信号与p75^NTR促凋亡信号的偏向。绒山羊中该系统的系统研究有限，proNGF/NGF比值通过下游转录组重编程影响毛囊细胞命运的机制尚不清楚。因此，研究人员以辽宁绒山羊为模型，研究proNGF/NGF比值动态变化及其通过TrkA/p75^NTR信号轴调控毛囊周期转换的分子机制。研究开展与意义：研究人员采集休止期、生长期和退行期皮肤，检测NGF、proNGF、TrkA、p75^NTR、Sortilin表达并计算比值；体外采用rHFSCs和hDPCs，设置11种处理并结合K252a，检测增殖与凋亡；对高比值、低比值及对照组进行转录组测序。结论表明，proNGF/NGF比值是毛囊周期转换的关键分子决定因素；生长期NGF/TrkA促存活占优，退行期proNGF/p75^NTR/Sortilin促凋亡占优；比值可作毛囊周期状态生物标志物，靶向该平衡或为绒山羊羊绒生长及人毛囊疾病治疗提供策略。

关键技术方法概述：样本来自辽宁省畜牧科学研究院辽宁绒山羊核心群6只成年雌性个体，分别于休止期（3月）、生长期（9月）、退行期（1月）取背部皮肤活检，每只3次，每个活检分用于H&E、qRT-PCR和Western blotting。体外采用大鼠毛囊干细胞（rHFSCs）和人真皮乳头细胞（hDPCs），设置11组处理，包括NGF、proNGF、不同proNGF/NGF比值及TrkA抑制剂K252a；CCK-8测增殖，流式细胞术测凋亡；选对照、高比值1.89和低比值0.56组行转录组测序，分析DEGs及GO/KEGG富集，qPCR验证。

研究结果：
3.1 毛囊组织学观察：通过H&E染色发现，三期毛囊群结构均可辨，生长期次级毛囊活性最高、毛囊/皮肤比更大，毛囊群结构更明显。
3.2 总RNA提取与qRT-PCR检测目标基因：总RNA的OD260/OD280为1.9–2.0；qRT-PCR显示NGF、proNGF mRNA在生长期显著升高，TrkA趋势一致；p75^NTR和Sortilin mRNA在退行期显著升高。
3.3 目标蛋白检测：Western blot显示NGF、TrkA蛋白在生长期显著高于休止期和退行期；proNGF、p75^NTR、Sortilin在退行期达峰，呈促存活系统与促凋亡系统拮抗表达。
3.4 proNGF/NGF蛋白表达比值动态变化：比值生长期最低为0.56，退行期最高为1.89，休止期为1.56。
3.5 实验细胞模型复苏与培养：rHFSCs呈多边形或短梭形，hDPCs呈典型成纤维样梭形，二者均稳定增殖。
3.6 CCK-8法检测细胞增殖：NGF单独显著促进两种细胞增殖，K252a消除该效应；proNGF单独无显著作用；比值1.56和1.89增殖率显著低于NGF单独组，与对照无显著差异；0.56与NGF单独组无显著差异但高于对照；加K252a后0.56组显著差异，比值低于1.56时增殖率高于相应K252a组。
3.7 细胞凋亡检测：流式细胞术显示proNGF单独凋亡率高于对照，NGF单独无显著变化；proNGF/NGF=1.56和1.89凋亡率高于空白对照。
3.8 转录组测序：
3.8.1 不同proNGF/NGF比值下毛囊细胞转录组谱：12个样本中，CON、NGF.H、NGF.L组分别获得211,792,840、186,452,776、176,533,966条clean reads；clean data总量83.64 Gb，clean reads比例97.9%–99.13%，Q30为94.24%–94.91%，GC含量49%–51%，测序质量合格。
3.8.2 关键凋亡相关DEGs鉴定：NGF.H vs CON有91个DEGs（62个上调、29个下调）；NGF.L vs CON有94个DEGs（40个上调、54个下调）；NGF.L vs NGF.H有96个DEGs（28个上调、68个下调），其中抗凋亡Faim2和Naip5显著下调。
3.8.3 凋亡与细胞死亡通路功能富集：NGF.L vs NGF.H的DEGs显著富集于“凋亡过程调节”（GO:0042981）和“细胞死亡”（GO:0008219），由Faim2、Naip5下调驱动。
3.8.4 类固醇激素和免疫相关代谢通路富集：NGF.H vs CON富集核糖体、视黄醇代谢，提示NGF占优时蛋白合成和代谢活跃；NGF.L vs NGF.H富集类固醇激素生物合成及沙门氏菌感染等免疫相关通路，提示proNGF占优时形成抑制生长、促进退化的微环境。
3.8.5 qPCR验证：7个DEGs中Abcd2、Pde1b、Mylk4上调，Faim2、Actn3、Naip5、Rgs7下调，趋势与RNA-seq一致，P > 0.05，确认测序可靠性。

讨论总结：研究人员提出“双系统拮抗”模型：生长期NGF/TrkA占优，退行期proNGF/p75^NTR/Sortilin占优，proNGF/NGF比值作为分子开关。H&E形态与Yao et al.观察一致。NGF/TrkA促进外根鞘细胞增殖，proNGF与p75^NTR/Sortilin形成促凋亡三元复合物。体外两种细胞结果一致，K252a阻断表明NGF促增殖依赖TrkA；比值>1.56促凋亡，0.56促增殖。转录组显示Faim2和Naip5同时下调削弱外源性和内源性凋亡抑制，类固醇激素生物合成可能参与退行期。与Peters et al.、人毛囊研究、Wang et al.等比较，本研究首次系统检测绒山羊proNGF和Sortilin，提出比值作为“分子指针”，并通过转录组揭示下游凋亡基因网络。局限包括仅三个时间点、体外用大鼠/人细胞而非山羊原代细胞、未直接检测MAPK/ERK、PI3K/Akt、JNK磷酸化、未做基因敲除/过表达、未体内注射NGF/proNGF。未来可建原代细胞、体内注射、敲低/过表达Sortilin/TrkA、筛选proNGF成熟蛋白酶。

结论翻译：proNGF/NGF系统在辽宁绒山羊毛囊周期中呈拮抗表达模式，其动态比值变化（0.56至1.89）是生长期向退行期转换的标志。毛囊细胞增殖与凋亡受proNGF/NGF相对比值调控：当比值≥1.56时促进凋亡；当比值为0.56时增强细胞增殖。当proNGF在proNGF/NGF系统中占优势时，通过下调抗凋亡分子并激活促凋亡通路，驱动毛囊细胞从增殖向凋亡的分子开关。