连接子依赖的 gH625–siRNA 缀合物实现无载体脑递送及 HSV-1 感染预防

《Industrial Chemistry and Materials》：Linker-dependent performance of gH625–siRNA conjugates enables carrier-free brain delivery and prophylaxis against HSV-1 infectionOpen Access

Nectin-1 是参与 HSV-1（单纯疱疹病毒1型）脑感染的主要进入受体，因此在病毒暴露前抑制其表达是一种潜在的宿主导向预防策略。siRNA（小干扰RNA）可可逆性降低 Nectin-1 表达，但向脑内高效递送仍较困难。在本研究中，研究人员将化学稳定的 siRNA 通过 C₁₂、PEG₄ 或 G₄ 连接子直接缀合至 HSV-1 衍生肽 gH₆₂₅。静脉给药后，C₁₂ 连接的 siRNA 缀合物显示出最强的脑相关荧光和基因沉默活性。单剂 siSod1-C₁₂-g 使脑 Sod1 mRNA 降低 42.9%。两剂 siN1-C₁₂-g 产生可检测的 Nectin1 mRNA 敲低，持续 2–3 周，并与 HSV-1 攻击后较低的病毒 gD 转录、较弱的病毒蛋白信号和降低的感染性病毒滴度相关。在测试剂量下未观察到明显的血液学、生化或组织学异常。在所检测的连接子中，C₁₂ 提供最佳功能性递送，且在暴露前降低 Nectin-1 可限制脑内 HSV-1 感染。

论文解读：

HSV-1（单纯疱疹病毒1型）具有高度嗜神经性，原发感染后可潜伏于感觉神经元并再激活，入侵中枢神经系统可导致单纯疱疹病毒脑炎，伴严重神经元损伤和持续神经功能缺损。一旦脑内感染建立，病毒进入早期事件和组织损伤难以逆转。HSV-1 进入需包膜糖蛋白 gB/gC 附着、gD 结合进入受体以及 gH/gL 与 gB 介导膜融合。Nectin-1（一种免疫球蛋白样细胞黏附分子和 HSV-1 进入受体）对感觉神经元和脑实质感染特别重要；小鼠颅内感染模型中，Nectin-1 缺失显著限制脑内病毒扩散并预防脑炎，而 HVEM 缺失作用较小。因此，暴露前瞬时降低 Nectin-1 可能减少进入位点并形成保护窗口。Nectin-1 是内源性细胞黏附蛋白，不适合永久抑制；siRNA（小干扰RNA）可通过序列特异性 mRNA（信使RNA）降解降低靶基因表达且不改变基因组，效应可持续数周至数月，但靶表达可随胞内 siRNA 清除而恢复。ESC（增强稳定化学）可提高核酸酶抗性和体内活性，但递送仍是主要限制，因 siRNA 大小和负电荷使其静脉给药后不易穿过 BBB（血脑屏障）或进入脑细胞。gH₆₂₅ 是 HSV-1 包膜糖蛋白 H 的 625–644 残基膜活性肽，可与脂膜相互作用并改善大分子货物细胞摄取，静脉给药后可在脑组织检出。此前多数研究将 gH₆₂₅ 用作纳米粒或脂质载体表面修饰，尚不清楚直接缀合 gH₆₂₅ 是否足以将化学修饰 siRNA 递送至脑并诱导基因沉默而无需额外载体。连接子可能通过疏水性、柔性及空间间隔影响与血清蛋白、细胞膜和组织相互作用，进而改变脑摄取和沉默活性。基于此，研究人员将 gH₆₂₅ 直接缀合至 ESC 修饰的靶向 Nectin1 的 siRNA，比较三种不可裂解连接子：十二烷基链（C₁₂）、四聚乙二醇（PEG₄）和四甘氨酸（G₄），疾病目标为限制脑内而非全身外周 HSV-1 感染。该论文发表在《Industrial Chemistry and Materials》。研究显示 C₁₂ 连接缀合物静脉给药后脑 Nectin1 表达降低最大，两剂间隔 3 天可维持基因沉默约 2 周并降低后续 HSV-1 感染严重程度，支持直接 gH₆₂₅ 缀合作为无载体脑 siRNA 递送方法，并表明连接子结构强烈影响体内活性。

关键技术方法概述：研究人员采用 Fmoc 固相肽合成制备叠氮修饰 gH₆₂₅ 和 G₄-gH₆₂₅ 肽，经 HPLC 纯化和质谱鉴定；通过固相亚磷酰胺化学合成 ESC 修饰 siRNA，在正义链 3′ 引入 linker–DBCO，经应变促进叠氮–炔环加成（SPAAC）与肽缀合，纯化后退火形成双链。体外用琼脂糖凝胶电泳评估血清和 RNase A 稳定性；体内用 Cy5 标记 siRNA 和 IVIS（活体成像系统）成像比较脑递送，用 RT-qPCR（逆转录定量聚合酶链反应）检测 Sod1、Nectin1 和 gD mRNA，用 Western blot（蛋白质印迹）和免疫组化检测病毒蛋白/抗原，用蚀斑试验测感染性病毒滴度，并用血液学、血清生化和 H&E（苏木精-伊红）染色评估安全性。动物为雌性 C57BL/6 小鼠，购自北京华福康生物科技有限公司；HSV-1 F 株购自 ATCC（VR-734）。

研究结果：
2.1 Design and physicochemical characterization of gH₆₂₅–siRNA conjugates：研究人员设计 C₁₂、PEG₄、G₄ 三种连接子；C₁₂ 和 PEG₄ 在正义链 3′ 引入，G₄ 在 gH₆₂₅ 合成时掺入四个甘氨酸。所有 siRNA 含 2′-F 或 2′-OMe 修饰，反义链 3′ 和 5′ 末端及正义链 5′ 末端磷酸二酯键替换为硫代磷酸酯，正义链 3′ 用于肽缀合且不含末端硫代磷酸酯。琼脂糖凝胶电泳显示 10% 胎牛血清 24 h 及 RNase A 24 h 后条带基本完整，表明强核酸酶抗性。
2.2 In vivo screening of linker structures and administration routes：比较脑室内注射、鼻内给药和尾静脉注射。脑室内注射 6 h 后脑荧光最强；鼻内给药几乎所有组接近 PBS 组，仅 Cy5-siNC-G₄-g 相对 PBS 约增加 20%（P=0.0253），无显著脑摄取；静脉给药所有缀合组均检测到脑荧光，Cy5-siNC-C₁₂-g 最强，PEG₄ 和 G₄ 略低于无额外连接子的 Cy5-siNC-g 但无统计学差异。以 Sod1 为模型，脑室内注射 7 天后游离 siSod1 和 siSod1-G₄-g 分别降低脑 Sod1 mRNA 19.5% 和 24.1%，其他无明确敲低；静脉给药后游离 siSod1 无降低，siSod1-PEG₄-g 平均降 21.8% 但不显著，siSod1-g、siSod1-C₁₂-g 和 siSod1-G₄-g 显著，siSod1-C₁₂-g 最大降低 42.9%。不同途径剂量不同，不能直接比较绝对效率。研究人员据此选择 C₁₂ 连接和静脉给药。
2.3 Screening of Nectin-1-targeting siRNA and determination of the dosing-to-challenge interval：筛选三条靶向小鼠 Nectin-1 的 siRNA，在 NIH/3T3 细胞中均使 Nectin-1 mRNA 降低超过 75%，N1 最大达 82.4%，被选用于体内。N1 反义链 5′ 加入 vP-mU，作为代谢稳定 5′-磷酸类似物并支持 AGO2（Argonaute 2）识别和装载，经 C₁₂ 缀合为 siN1-C₁₂-g。Cy5 标记后静脉给药，脑信号 4 h 最高，8 h 明显下降，24 h 弱可检测，36 和 72 h 接近背景；Cy5 成像不能区分完整缀合物与降解产物或游离染料。两剂间隔 3 天，第一剂后 2 周和 3 周测脑 Nectin-1 mRNA：游离 siN1 无敲低；siN1-C₁₂-g 显著降低，2 周敲低 20.1%，3 周 13.7%。因 2 周抑制更强，HSV-1 攻击安排在第一剂后 14 天、第二剂后 11 天。
2.4 siN1-C₁₂-g reduces HSV-1 infection in the brain：两剂静脉给药间隔 3 天，第一剂后 14 天鼻内 HSV-1 攻击，攻击后 8、16、24、48、72 h 收集脑组织。72 h 观察无严重神经异常；因随访仅 72 h 且无正式神经评分，模型解释为早期 HSV-1 脑感染而非临床确立脑炎。RT-qPCR 测 gD 转录：8 h 仅低水平；16 h PBS、游离 siN1 和 siN1-C₁₂-g 相对表达为 41.31、103.01 和 8.43，siN1-C₁₂-g 为 PBS 的 20.4% 但差异不显著；24 h PBS 和游离 siN1 明显升高，siN1-C₁₂-g 保持低且显著低于两组；48 和 72 h siN1-C₁₂-g 为 PBS 的 3.4% 和 2.2%，但差异不显著。时间过程显示 siN1-C₁₂-g 组 gD 水平在整个观察期数值上低于 PBS 和游离 siN1。Western blot 显示 48 和 72 h siN1-C₁₂-g 的 gD 条带较弱，72 h 免疫组化染色较少，但未消除感染。蚀斑试验中 PBS 和游离 siN1 组滴度全程接近 5.0 log₁₀ PFU mL^?1 且无显著差异；siN1-C₁₂-g 组 8 h 为 4.94 log₁₀ PFU mL^?1，16、24、48、72 h 分别降至 4.86、4.38、3.77、3.49 log₁₀ PFU mL^?1，从 16 h 起显著低于两对照组。游离 siN1 无保护作用。结论为 siN1-C₁₂-g 预处理降低病毒转录、蛋白表达和感染性滴度，支持其预防 HSV-1 脑感染。
2.5 Preliminary in vivo safety assessment of siN1-C₁₂-g：测血液学、血清生化和脑及主要器官组织学。WBC（白细胞计数）、LYM（淋巴细胞计数）、GRAN（粒细胞计数）无显著差异；RBC（红细胞计数）、Hb（血红蛋白）、HCT（血细胞比容）、MCV（平均红细胞体积）相当且正常；PLT（血小板计数）、MPV（平均血小板体积）无显著变化。ALT（丙氨酸氨基转移酶）、AST（天冬氨酸氨基转移酶）、CREA（肌酐）、UREA（尿素）、CK（肌酸激酶）、LDH（乳酸脱氢酶）无异常。H&E 染色显示脑、心、肝、脾、肺、肾形态相当，无坏死、炎症浸润、出血等，脑无结构异常。测试剂量和观察时间内无短期毒性。

讨论部分总结：研究人员指出，连接子不仅是肽与 siRNA 的物理间隔。C₁₂ 为疏水烷基链，PEG₄ 为亲水聚醚，G₄ 为含酰胺键的亲水肽序列；C₁₂ 增加缀合物疏水性，疏水基团可改变寡核苷酸与血清蛋白、脂蛋白和细胞膜相互作用，可能影响循环、组织摄取和胞内递送。但实验未区分哪一步贡献最大；因未检测仅 C₁₂ 的 siRNA，不能分离 C₁₂ 的独立贡献，结论限于在含 gH₆₂₅ 构建中 C₁₂ 是表现最佳的间隔子。C₁₂ 在成像和基因沉默中均表现较好，提示疏水性是重要设计变量；PEG₄ 或 G₄ 未改善功能递送，说明更亲水连接子不一定有利于脑递送。连接子应作为完整缀合物评估，比较不同长度烷基链和可裂解连接子可能有助于明确疏水性和胞内释放的影响。脑相关荧光与基因沉默不匹配：脑室内注射产生最强 Cy5 信号，但多数缀合物未引起相应 Sod1 降低；静脉 siSod1-C₁₂-g 总荧光较低但敲低最大。IVIS 测总荧光，不能区分完整缀合物与血管、脑脊液、胞外滞留或 Cy5 标记降解产物；基因沉默需完整 siRNA 进入细胞、到达胞质并装载 RISC（RNA 诱导沉默复合物）。静脉 Cy5-siN1-C₁₂-g 脑信号 4 h 最高，8 h 下降，24 h 弱，36 和 72 h 接近背景，而 Nectin1 敲低持续数周，提示少量 siRNA 到达有效胞内区室后可在大量组织荧光消失后继续作用。组织成像适用于初始分布评估，功能基因沉默应作为主要终点。Nectin-1 是 HSV-1 感染神经元和脑实质的重要进入受体，暴露前瞬时降低其表达可能减少感染和扩散所需受体位点；该策略旨在暴露前降低脑易感性，而非预防潜伏再激活。暴露后 Nectin-1 沉默不直接影响已内化病毒，但对后续易感细胞感染或细胞间传播的影响需单独研究。攻击后 8 h 三组感染滴度相似，说明预处理未明显改变早期脑内病毒量；PBS 和游离 siN1 滴度后续接近 5 log₁₀ PFU mL^?1，siN1-C₁₂-g 逐步降至 72 h 3.49 log₁₀ PFU mL^?1。gD 转录和蛋白方向相似，但并非每个时间点显著。siN1-C₁₂-g 未完全阻止脑感染，但结果符合减少易感细胞感染或限制细胞间传播，从而限制继续产生感染性病毒。全脑 Nectin1 平均降低约 20% 与约 1.5-log₁₀ 病毒滴度下降相关；全脑测量可能低估与 HSV-1 感染最相关细胞群中的敲低。中等降低受体可用性可能在反复受体依赖病毒扩散中更重要；测定特定脑区和细胞类型的 Nectin1 敲低及受体丰度与感染关系有助于阐明瞬时受体抑制产生保护的机制。

研究结论部分翻译：在本研究中，研究人员将 HSV-1 衍生肽 gH₆₂₅ 直接缀合至化学稳定 siRNA，并比较三种连接子设计用于脑递送。C₁₂ 连接缀合物静脉给药后表现出最佳脑相关荧光和基因沉默活性。当靶向 Nectin1 时，两剂静脉给药维持脑内基因敲低 2–3 周，并降低 HSV-1 攻击后病毒转录、病毒蛋白表达和感染性病毒滴度。在测试剂量和观察期内未观察到明显血液学、生化或组织学异常。这些发现表明连接子化学强烈影响 gH₆₂₅–siRNA 缀合物的体内活性，且瞬时降低 Nectin-1 可减轻脑内 HSV-1 感染。