《Food and Function》：Metabolomic signatures of probiotic secretomes reveal strain-specific biofunctional potential: insights from Lacticaseibacillus rhamnosus R0011 and Bifidobacterium longum R0175Open Access
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摘要专业翻译
益生菌分泌组是细菌生长过程中产生的无细胞副产物，其中含有生物活性代谢物。这些代谢物具有抗氧化和抗炎作用，并介导宿主-微生物及微生物-微生物间的相互作用。然而，益生菌分泌组的代谢组学特征具有菌株特异性，尚未得到充分研究。研究人员采用非靶向代谢组学分
摘要专业翻译
益生菌分泌组是细菌生长过程中产生的无细胞副产物，其中含有生物活性代谢物。这些代谢物具有抗氧化和抗炎作用，并介导宿主-微生物及微生物-微生物间的相互作用。然而，益生菌分泌组的代谢组学特征具有菌株特异性，尚未得到充分研究。研究人员采用非靶向代谢组学分析，表征了鼠李糖乳酪杆菌（Lacticaseibacillus rhamnosus）R0011（R11）分泌组（LR）和长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）R0175（R175）分泌组（BL）的代谢组学特征。LR和BL具有截然不同的代谢组学特征。LR表现出更高的支链羟基酸和芳香族乳酸、甘露醇/山梨醇、甲羟戊酸（mevalonate）和黄素单核苷酸（flavin mononucleotide, FMN）相对丰度。BL的特征则是吲哚乳酸（indolelactate, ILA）、γ-谷氨酰氨基酸、烟酸相关代谢物以及三羧酸循环中有机酸的相对丰度较高。本研究首次揭示了这两种广泛使用的益生菌菌种独特的代谢组学特征，为其在宿主健康和微生物组调节中的菌株特异性作用提供了新见解。
论文解读文章
一、研究背景与目的
乳酸菌（lactic acid producing bacteria, LAB）主要包括乳杆菌属（Lactobacillus）和双歧杆菌属（Bifidobacterium），广泛存在于发酵食品和人体共生微生物组中。补充这些乳酸菌可通过其抗氧化、抗炎和益生特性正向调节肠道和宿主健康。然而，乳杆菌和双歧杆菌与宿主相互作用的机制尚未完全阐明。新兴的体外研究已报道，这些益生菌的无细胞上清液（cell-free supernatants, CFS）具有抗氧化和抗炎作用。例如，植物乳杆菌（L. plantarum）CFS表现出铁螯合和自由基清除能力，其T1菌株CFS通过增加超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）和过氧化氢酶活性、减弱过氧化氢（H2O2）产生并抑制核因子κB（nuclear factor kappa B, NFκB）活性，从而减轻脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）诱导的小鼠巨噬细胞炎症和氧化应激。动物双歧杆菌（B. animalis）BB12 CFS可减弱肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor, TNF）-α诱导的Caco-2细胞白介素（interleukin, IL）-8产生。因此，益生菌的健康益处可通过其CFS介导。
益生菌分泌组是细菌生长过程中产生的CFS，主要生物活性代谢物包括乳酸、短链脂肪酸（short-chain fatty acids, SCFAs）、胞外多糖（exopolysaccharides, EPS）、细菌素、氨基酸和维生素。这些代谢物不仅支持益生菌生长，还可能介导益生菌与宿主之间的相互作用。例如，嗜酸乳杆菌（L. acidophilus）来源的吲哚-3-乳酸（indole-3-lactate, ILA）可减轻小鼠结肠炎症并增加IL-22产生，植物乳杆菌CFS来源的EPS和苯乳酸（phenyllactate, PLA）具有抗氧化特性。因此，研究人员假设分泌组中的生物活性代谢物有助于益生菌的抗炎和抗氧化潜力。
乳杆菌和双歧杆菌的代谢组学特征已在食品基质发酵和多酚膳食成分发酵背景下被研究，以选择适合食品生产的菌株。其他益生菌代谢组学分析主要集中于鉴定具有抗微生物和抗真菌作用或参与生物膜形成的化合物。由于基因组差异可能影响代谢通路活性，代谢组学特征部分具有菌株特异性。因此，需要对乳杆菌和双歧杆菌分泌组的代谢组学特征及其具有抗氧化和抗炎潜力的主要代谢物进行全面分析。
本研究旨在利用非靶向代谢组学分析，研究LR和BL分泌组的代谢组学特征。选择这两个菌株基于研究人员前期工作，该工作证明了其分泌组对多氯联苯（polychlorinated biphenyl, PCB）诱导的人肠上皮细胞（T84）炎症具有抗炎和抗氧化作用。BL的抗炎作用部分由L-乳酸和乙酸盐驱动，而LR则并非如此。因此，分泌组中其他生物活性代谢物很可能促成了抗炎和抗氧化作用。
二、研究内容与主要结论
研究人员采用非靶向代谢组学分析（Ultrahigh Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectroscopy, UPLC-MS/MS）对LR和BL的代谢组学特征进行了全面表征，共鉴定出224种代谢物。主成分分析（principal component analysis, PCA）显示前两个主成分解释了91%的累计方差，表明两种分泌组在组成上存在显著的菌株特异性差异。方差分析（ANOVA）结合Tukey's HSD检验显示，LR相对于培养基对照（media control, MC）有145种差异代谢物，BL有141种，LR与BL之间有159种差异代谢物。
通路分析显示，LR中丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、嘧啶代谢以及甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢发生显著变化；BL中精氨酸生物合成、丙氨酸/天冬氨酸/谷氨酸代谢、嘧啶代谢以及烟酰胺和烟酸代谢为显著变化通路。值得注意的是，这些通路中的代谢物水平多呈下降趋势，如色氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸和天冬酰胺在分泌组中低于MC，表明微生物在生长过程中消耗了培养基中的这些代谢物。
三、主要技术方法
本研究使用的主要技术方法包括：非靶向代谢组学分析，采用超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）技术，由Metabolon公司（Morrisville, NC）完成，通过四种色谱方法鉴定亲水和疏水化合物，质谱扫描范围覆盖70至1000 m/z，使用认证生化标准品库进行峰鉴定和质量控制；统计学分析采用R 4.3.2软件，进行方差分析（ANOVA）和Benjamini-Hochberg多重检验校正，FDR校正p值<0.05的代谢物进一步进行Tukey's HSD两两比较；通路分析使用MetaboAnalyst 6.0软件，以鼠李糖乳杆菌GG和长双歧杆菌NCC2705的KEGG通路库为参考；多元分析使用MixOmics包生成PCA图，pheatmap包生成热图。样本来源为LR（n=5）和BL（n=4）生物学重复，DMEM:F12培养基（n=3）作为培养基对照。
四、研究结果
B1. LR和BL的全局代谢组学特征和通路分析
共鉴定224种代谢物，PCA前两个主成分解释了91%的累计方差，表明分泌组组成存在显著的菌株特异性差异。LR相对于MC有145种差异代谢物，BL有141种，LR与BL之间有159种差异代谢物。通路分析显示LR中丙氨酸/天冬氨酸/谷氨酸代谢、嘧啶代谢和甘氨酸/丝氨酸/苏氨酸代谢显著变化；BL中精氨酸生物合成、丙氨酸/天冬氨酸/谷氨酸代谢、嘧啶代谢和烟酰胺/烟酸代谢显著变化。色氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺等氨基酸在分泌组中水平降低，表明微生物生长过程中消耗了这些代谢物。
B2. LR和BL在碳水化合物和能量代谢中的代谢组学特征
LR表现出葡萄糖、丙酮酸、核糖酸和果糖水平降低，而葡萄糖-6-磷酸（G6P）、甘油酸、磷酸二羟丙酮（DHAP）、乳酸、景天庚酮糖、核酮糖/木酮糖、赤藓糖酸和核糖水平升高。能量代谢相关代谢物包括磷酸、琥珀酸、苹果酸和α-酮戊二酸（α-KG）在LR中显著增加。LR还增加了糖醇甘露醇/山梨醇和氨基糖N-乙酰葡糖胺/N-乙酰半乳糖胺（GlcNAc/GalNAc）的水平。BL表现出丙酮酸降低，但甘油酸、DHAP、G6P、磷酸、景天庚酮糖、赤藓糖酸、核糖和乳酸升高。BL中三羧酸循环中间产物琥珀酸、苹果酸、乌头酸、α-KG、柠檬酸和延胡索酸显著增加，且α-KG、琥珀酸和苹果酸水平显著高于LR。这些代谢特征与鼠李糖乳杆菌兼性异型发酵和双歧杆菌特有的“双歧分流”（bifid shunt）发酵途径一致。本研究首次报道了LR中甘露醇/山梨醇的鉴定以及双歧杆菌分泌组中乌头酸和柠檬酸的产生。
B3. LR和BL在脂质代谢中的代谢组学特征
LR显著增加了甲羟戊酸（mevalonate）、甘油-3-磷酸（G3P）、2-羟基戊二酸（2-HG）、甘油磷酸甘油和2R,3R-二羟基丁酸的水平。BL也显著增加了G3P、2-HG和2R,3R-二羟基丁酸，但甲羟戊酸水平与MC相比无变化。甲羟戊酸仅在LR中鉴定到，与鼠李糖乳杆菌GG上清液中存在该代谢物的报道一致。2-HG在LR和BL中均增加，LR中2-HG的增加可能源于α-KG的增加。本研究首次报道了双歧杆菌分泌组中2-HG的存在，以及乳杆菌和双歧杆菌在无甘油补充的培养基中产生G3P、甘油和甘油磷酸甘油。
B4. LR和BL在维生素和辅因子代谢中的代谢组学特征
在烟酸代谢中，LR的烟酰胺（NAM）水平显著降低，而烟酸（NA）和烟酰胺核糖苷（NR）显著增加。BL中NA和NAM代谢通路显著受影响，NAM显著降低，而NA、NR、烟酸单核苷酸（NaMN）、NAD+和烟酸核糖核苷显著增加。两种菌株可能利用NAM合成NAD+及其前体。在维生素B族其他代谢方面，LR和BL均显著增加了吡哆胺、吡哆酸和5-(2-羟乙基)-4-甲基噻唑的水平。核黄素代谢来源的代谢物仅在LR中显著变化，核黄素降低而黄素单核苷酸（FMN）显著增加。
B5. LR和BL在外源物代谢中的代谢组学特征
2-酮-3-脱氧葡糖酸在LR中水平最高，该代谢物可来源于多糖或葡糖酸分解代谢。2-异丙基苹果酸和2,3-二羟基异戊酸在BL中显著增加，2,3-二羟基异戊酸是2-氧代异戊酸和2-异丙基苹果酸的前体。本研究首次报道了LR在不添加植物或动物来源多糖的情况下产生2-酮-3-脱氧葡糖酸，以及双歧杆菌分泌组中这些代谢物的存在。
B6. LR和BL在氨基酸和肽代谢中的代谢组学特征
氨基酸代谢是LR和BL中代谢物数量最多的超通路。天冬酰胺、果糖赖氨酸和天冬氨酸在LR中降低最显著；天冬氨酸、谷氨酸和果糖赖氨酸在BL中降低最显著。N-乙酰化氨基酸、N-乳酰氨基酸、2-羟基-4-(甲硫基)丁酸（HMTBA）、S-1-吡咯啉-5-羧酸（P5C）、3-(4-羟苯基)乳酸（HPLA）、苯乳酸（PLA）以及支链羟基酸（BCHAs）包括2-羟基-3-甲基戊酸（HMVA）、α-羟基异己酸（HICA）和α-羟基异戊酸（HIVA）在LR和BL中均显著增加，且LR显著高于BL。ILA、半胱氨酸和高半胱氨酸在两种分泌组中均显著增加，且BL显著高于LR。γ-谷氨酰氨基酸仅在BL中显著增加。结果表明R11具有更高的PLA、HPLA和BCHAs相对丰度，而R175具有更高的ILA、半胱氨酸、高半胱氨酸和γ-谷氨酰氨基酸相对丰度。
B7. LR和BL在核苷酸代谢中的代谢组学特征
嘧啶代谢在LR和BL中均显著受影响。嘌呤和嘧啶前体包括次黄嘌呤、天冬酰胺和天冬氨酸在LR和BL中显著降低，表明两种菌株消耗天冬氨酸以激活嘧啶生物合成。LR和BL均显著增加了肌苷、鸟苷、腺苷、乳清酸、胞嘧啶和腺苷5'-单磷酸（AMP）的水平。LR中肌苷水平高于BL。LR还增加了腺嘌呤，BL增加了二氢乳清酸。嘧啶生物合成代谢物二氢乳清酸、胞苷和胞嘧啶以及嘌呤生物合成代谢物2-脱氧鸟苷在BL中显著高于LR。腺嘌呤在LR中比BL高5倍。这些结果表明R11和R175中嘌呤和嘧啶代谢被激活，R11以腺嘌呤生物合成更为突出，R175以胞嘧啶和鸟苷生物合成更为突出，与双歧杆菌基因组具有更高G和C含量一致。
五、讨论总结与研究结论
讨论部分总结
本研究证明了LR和BL益生菌分泌组具有不同的代谢组学特征，提示鼠李糖乳杆菌R0011和长双歧杆菌R0175具有菌株特异性效应。LR表现出更高的糖醇甘露醇/山梨醇、BCHAs、PLA、HPLA和FMN相对丰度。FMN不仅能促进乳杆菌的电子传递和能量产生，还能促进乳杆菌在小鼠盲肠中的定殖和黏附。甘露醇和山梨醇通过其益生元特性介导宿主-微生物相互作用。BCHAs（HIVA、HICA和HMVA）具有抗氧化和抗炎潜力，HICA可减弱TNF-α和IFN-γ诱导的氧化应激和炎症。PLA和HPLA具有抗氧化、抗炎和益生元效应，PLA可通过下调TLR4/NFκB信号传导减轻鼠伤寒沙门氏菌诱导的结肠炎症。
BL的特征是ILA、γ-谷氨酰氨基酸、烟酸相关代谢物和三羧酸循环有机酸（苹果酸、α-KG和琥珀酸）相对丰度较高。ILA可通过激活芳香烃受体（aryl hydrocarbon receptor, AhR）减轻DSS诱导的小鼠结肠炎。γ-谷氨酰氨基酸可能通过增加谷胱甘肽水平并抑制NFκB激活和IL-8产生而发挥抗氧化和抗炎作用。烟酸相关代谢物NA、NR、NAD+和NaMN具有抗氧化和抗炎潜力，NAD+前体补充可恢复线粒体功能并减轻溃疡性结肠炎小鼠的氧化应激和炎症。苹果酸可增加老年大鼠肝脏抗氧化酶活性和谷胱甘肽水平，α-KG可减轻结肠炎小鼠的肠道炎症并改善肠道屏障功能，同时具有益生元效应。琥珀酸的作用尚不明确，一方面可作为肠道糖异生的底物改善葡萄糖耐受，另一方面其积累可激活琥珀酸受体（SUCNR1）进而激活炎症小体，诱导促炎细胞因子产生，与IBD相关。
研究结论
本研究检测了R11和R175培养物产生的益生菌分泌组的代谢组学特征。观察到的分泌组含有大量生物活性代谢物。在LR中，生物活性代谢物主要来源于支链氨基酸代谢、芳香族氨基酸代谢、碳水化合物/能量代谢和嘧啶代谢。LR表现出BCHAs、PLA、HPLA、甘露醇/山梨醇和维生素B2代谢物如FMN的相对丰度增加。在BL中，主要生物活性代谢物来源于芳香族氨基酸代谢、肽代谢、嘧啶代谢、NAM代谢和碳水化合物/能量代谢。BL的特征是ILA、γ-谷氨酰氨基酸、烟酸相关代谢物和三羧酸循环有机酸的相对丰度较高。
值得注意的是，虽然许多分泌分子具有潜在抗炎和抗氧化作用，但有些也可能反而促进炎症或氧化应激。这凸显了需要进一步阐明的复杂效应相互作用。特别是浓度依赖性效应需要未来的定量研究，以进一步理解细菌分泌组与肠道炎症之间的复杂相互作用。未来研究还可使用同位素示踪剂来检测LR和BL中的营养消耗和生物活性代谢物产生。这些结果也为未来临床前和临床研究提供了指导，以识别可用于评估益生菌补充与宿主健康益处相关性的生物标志物代谢物。
