用于癌症相关miRNA生物传感的CRISPR与功能性核酸结构：识别转换、纳米界面与分析权衡

《TrAC Trends in Analytical Chemistry》：CRISPR and functional nucleic acid architectures for cancer-associated miRNA biosensing: Recognition conversion, nanointerfaces, and analytical trade-offs

•比较了不同CRISPR效应蛋白中短miRNA的识别-转换路线。•对拆分式crRNA、拆分式激活器和核酸回路进行了严格评估。•根据放大、富集、递送和调控功能对纳米界面进行分类。•在代表性平台之间比较了最低检测限之外的分析权衡。•评估了从体外感知到细胞内感知和诊疗一体化的转化过程。

引言

癌症仍然是严峻的全球健康挑战，其特征是高发病率和死亡率，这主要归因于晚期诊断和肿瘤的分子异质性。根据最新的GLOBOCAN 2024年估计数据，2024年全球约有2060万例新发癌症病例和980万例癌症相关死亡，预计到2050年，每年新发病例将达到3440万例。[1]，[2] 肿瘤管理范式正日益向精准医学转变，其中早期检测和个性化治疗干预变得越来越重要。在多种生物标志物中，miRNA（一组长度为18-25个核苷酸的小非编码RNA）已成为转录后基因表达的关键调控因子。其失调与肿瘤发生、转移和耐药性密切相关，使其成为多种恶性肿瘤的"分子指纹"。除了其功能角色外，miRNA在临床生物流体（如血液、唾液和尿液）中的固有稳定性——被包裹在外泌体中或与蛋白质结合——使其成为微创液体活检、疾病监测和治疗反应评估的有前景的候选者。

然而，基于miRNA的诊断技术的临床转化受到其固有理化性质的严重阻碍，包括序列短、体内丰度极低、家族内序列同源度高以及易降解。已建立的检测技术，如定量实时聚合酶链式反应（qRT-PCR）、northern印迹和下一代测序（NGS），虽然稳健，但仍面临持续性挑战，包括需要精密的实验室设施、较长的处理时间以及潜在的扩增偏差，这些因素共同限制了其在即时检测（POCT）和实时临床监测中的应用。因此，仍然需要能够更好平衡高灵敏度、单碱基区分能力和操作简便性的传感平台。

CRISPR和CRISPR相关（Cas）系统的出现扩展了分子诊断工具箱。除了对基因组编辑的革命性影响外，某些Cas效应蛋白（如Cas12、Cas13和Cas14）表现出独特的附加切割活性。这提供了一种由特定靶标识别触发的可编程反式切割机制。这一特性能够将单次miRNA识别事件转化为稳健的放大信号，提供能够区分单核苷酸多态性（SNPs）的特异性。尽管具有这些优势，未经修饰的"裸"CRISPR系统在复杂生物基质中可能表现不佳。它们可能会受到生物流体中信号干扰的影响，在细胞内miRNA成像中存在低递送效率，以及可能损害检测准确性和治疗安全性的脱靶效应。

纳米材料不仅仅是辅助载体，而是通过信号放大、酶稳定化、靶向递送和时空激活来增强CRISPR性能的多功能界面。这种互补关系已将CRISPR-纳米技术系统从生物传感平台扩展至细胞内成像和选择性传感响应型诊疗应用。纳米材料如金纳米颗粒（AuNPs）、氧化石墨烯（GO）和金属有机框架可作为稳定CRISPR酶、放大传感信号和实现靶向细胞内递送的通用支架。CRISPR系统与纳米技术之间的协同作用不仅提高了传统miRNA检测方法的分析灵敏度，还将应用范围从体外生物传感扩展到细胞内成像、诊疗调控和精准医学（图1A）。[3]，[4]

为了进一步揭示该领域的发展趋势和交叉学科特征，我们基于Web of Science核心合集进行了文献计量分析。如图1B-D所示，关键词共现分析和知识网络可视化显示了一个以"CRISPR"、"纳米颗粒"和"miRNA"为中心的高度互联的研究格局。"CRISPR/Cas"和"纳米颗粒/递送"簇之间的强连接突出了纳米材料在信号放大和细胞内递送中的双重作用。语义可视化进一步识别出"激活"和"表达"为该领域的主要研究热点。此外，2015年至2025年间的年度和累计出版物数量的快速增长（图1E）反映了CRISPR纳米技术驱动的miRNA系统日益增长的学术兴趣和转化潜力。

在本综述中，我们提供了CRISPR使能的癌症miRNA生物传感最新进展的全面综合，同时重点关注三个仍未充分解决的三个分析问题。第一，短miRNA靶标如何被转换为能够直接或间接激活不同CRISPR效应蛋白的分子输入？第二，拆分式crRNA、拆分式激活器、催化或杂交回路和纳米界面如何处理背景泄漏、反应动力学、序列区分和局部信号产生？第三，这些工程策略在灵敏度、单核苷酸区分、多重检测、基质耐受性、检测时间和操作复杂性之间引入了哪些权衡？在这一框架内，适配体被视为用于分子门控的互补模块、将非核酸识别事件转换为CRISPR兼容输入、细胞外囊泡富集和信号产生，而序列互补杂交仍然是成熟miRNA靶标的主要识别机制。[5] 因此，我们首先总结癌症相关miRNA的分析特性和代表性CRISPR/Cas效应蛋白的识别机制，然后讨论功能核酸结构、纳米界面辅助的信号产生、体外和细胞内感知、传感响应型诊疗扩展以及转化挑战。这一从机制到性能的视角旨在补充近期以平台和应用为中心的综述，并根据分析和转化需求为选择CRISPR-miRNA传感架构提供实用指导。

各部分概要

**miRNA作为新兴癌症生物标志物：基础与临床潜力**
miRNA是调控转录后基因表达的小非编码RNA。它们主要通过触发靶mRNA降解或阻断蛋白质翻译来发挥作用。这些分子是许多生物通路中的核心调节因子。由于其表达模式在许多人类癌症中失调，它们是有用的肿瘤相关生物标志物。它们在体液中相对稳定的特性也促进了无创液体活检策略的开发。然而，

**miRNA传感中不同CRISPR效应蛋白的识别转换**
CRISPR/Cas系统提供了可编程的核酸识别和靶标触发的切割机制，可适配miRNA传感。然而，不同的Cas效应蛋白需要不同的分子输入，这一区别对于短miRNA靶标尤为重要。因此，本节保留了代表性Cas9、Cas12a、Cas13a和Cas12f/Cas14相关系统的机制概述，但重点讨论了成熟miRNA如何被直接识别或转换为

**CRISPR-miRNA信号产生的功能核酸结构和纳米界面**
为了解决CRISPR系统在复杂生物环境中的局限性，研究人员将CRISPR效应蛋白与可编程核酸模块和功能纳米材料相结合，以提高分子输入兼容性、信号产生、靶标富集、稳定性和细胞内递送。[44]，[45]，[46]，[47] 本节讨论了适配体辅助的识别转换和信号产生，随后根据纳米界面的功能对其进行分类：

**CRISPR-miRNA生物传感中的分析性能与权衡**
CRISPR-miRNA生物传感器的分析性能应在报告的最低检测限（LOD）之外进行评估。识别-转换机制、放大依赖性、样品基质、动态范围、序列区分、多重检测模式、检测时间和操作复杂性的差异可能显著影响实际性能。因此，本节根据所解决的分析问题和各策略引入的权衡，比较了代表性的体外平台：

**基于CRISPR的细胞内miRNA成像**
除了体外检测外，细胞内miRNA动态监测可以提供与肿瘤异质性和治疗反应相关的空间和时间信息。此类应用需要低背景、生物相容性和高效的细胞内递送，这些目标仅靠未经修饰的CRISPR组件难以实现。[153]，[154]，[155]

**传感响应型和闭环诊疗扩展**
此处仅包含miRNA识别作为分子输入直接触发、门控或空间控制下游CRISPR或治疗反应的治疗应用。这种传感-行动耦合将传感响应型诊疗与一般的CRISPR癌症治疗区分开来。代表性系统包括miRNA响应型货物释放、拆分式激活器控制的CRISPR激活、逻辑门控诊疗和miRNA传感引导RNA架构。

**临床转化挑战与未来展望**
尽管CRISPR纳米技术增强的miRNA诊疗取得了 remarkable的初步进展，但大规模临床应用仍面临独特挑战。为帮助读者优先安排工作，我们将其分为三个层次：(1)技术性能瓶颈（灵敏度、特异性、PAM依赖性），(2)标准化和监管挑战（批次一致性、质量控制、安全数据），(3)伦理和数据管理问题（图11）。

**结论与展望**
CRISPR使能的miRNA生物传感已从简单的附加切割检测进展为整合靶标识别、功能核酸工程和纳米界面调控的可编程分析系统。关键设计原则是分析性能由完整的识别-转换路径决定，而非由Cas效应蛋白或纳米材料单独决定。直接RNA识别、分子转换、拆分式crRNA或拆分式激活器组装

CRediT作者贡献声明
Peng Weipan：写作-审阅与编辑。Man Shuli：写作-审阅与编辑，监督，项目管理，概念化。Peng Yang：写作-初稿。Qi Hexin：写作-初稿。Ma Long：写作-审阅与编辑，写作-初稿，监督，项目管理，方法论，调查，资金获取，概念化。An Huimin：写作-审阅与编辑，写作-初稿。Yang Ying：写作-审阅与编辑，写作-初稿。Guo Yujie：写作-审阅与编辑，写作-初稿。

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作者声明不存在利益冲突。

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在准备本工作期间，作者使用ChatGPT（OpenAI）和DeepSeek进行语言润色、句子重组和提高初稿的可读性。这些工具未用于生成科学数据、分析、解释或结论。在使用这些工具后，作者对所辅助的AI内容进行了严格审阅、验证和编辑，对已发表文章的内容承担全部责任。

利益冲突声明
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致谢
本工作得到中国国家自然科学基金（编号：32602070、32372415和32572693）、天津市科学技术委员会（编号：23JCJQJC00090）、天津市自然科学基金联合基金（编号：25JCLMJC00050）和天津科学与技术重大研究专项（编号：TUST2026-02-06-03）的资助。

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