《Nanoscale Advances》：Stimuli-responsive vesicles in water-resistant nanofibers for molecular random access in DNA data storageOpen Access
编辑推荐：
DNA是数据存储的一种有吸引力的介质。实现高效随机访问（random access）对于基于DNA的存储器的实际应用至关重要。研究人员提出了一种随机访问策略，其基于从纳米纤维网基质中选择性释放目标DNA。编码在DNA序列集合中的信息被封装在刺激响应性小单层囊泡
DNA是数据存储的一种有吸引力的介质。实现高效随机访问（random access）对于基于DNA的存储器的实际应用至关重要。研究人员提出了一种随机访问策略，其基于从纳米纤维网基质中选择性释放目标DNA。编码在DNA序列集合中的信息被封装在刺激响应性小单层囊泡（small unilamellar vesicles, SUVs）内部，并嵌入电纺（electrospinning）耐水纳米纤维网中。目标序列利用正交的基于pH的触发条件被选择性释放。这些触发条件的正交性使得含有未选择DNA的SUVs得以保留，这些DNA保留在纤维网中以供后续检索。该工作将序列非依赖性化学寻址（sequence-independent chemical addressing）与物理区室化（physical compartmentalization）及双层保护（double-layered protection）相结合。它代表了面向耐水纤维中随机访问的聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）非依赖性分子选择系统的初始步骤，并可能在基于DNA的存储架构中具有应用潜力。
研究背景与问题：DNA因高信息密度、稳定性和耐久性，已成为长期数字数据存储的有前景平台。DNA合成（写入）与下一代测序（读取）技术发展，使DNA数据存储接近现实档案介质。但存储数据完整性与检索仍面临挑战。为保护DNA免受环境降解，研究人员探索了二氧化硅纳米颗粒、可重复使用非破坏性电纺纳米纤维基质、热响应微胶囊和金属有机框架（metal–organic frameworks, MOFs）等；也开发了Goldman方法、DNA Fountain和Yin-Yang Codec等纠错码。放大DNA数据存储系统需随机访问（random access），即选择性检索特定数据集而不读取整个档案。目前多通过聚合酶链反应（PCR）扩增实现，依赖引物定位和扩增特定DNA序列。但PCR随机访问存在缺陷：聚合酶误掺入核苷酸导致错误、对引物-模板错配敏感、可产生扩增偏差，可能导致数据损坏和非目标序列丢失，尤其竞争序列存在时；且能耗高，需热循环、专用试剂和优化条件，增加时间和成本。已有PCR独立随机访问方法，包括光子微球与光学显微镜、多色荧光标记微粒与流式细胞术、Cas9定向选择，但常需专用昂贵设备和复杂流程，对终端用户困难。因此，研究人员提出一种概念验证的PCR独立选择方法，作为双层保护系统，无需选择性酶扩增，可靶向检索同一物理空间共定位的分离序列。通过将编码DNA封装在刺激响应性SUVs内，释放由外部刺激选择性触发，实现顺序和选择性数据恢复而不破坏非靶向数据。
研究人员开展的研究、结论与意义：研究人员将数据编码DNA封装于pH响应SUVs，嵌入电纺耐水纳米纤维网，利用正交pH触发选择性释放。酸性pH响应SUVs由DOPE:CHEMS组成，碱性pH响应SUVs由DSPA:DPPC组成。结果显示，pH 5.5仅释放DNA1，pH 10仅释放DNA2，非靶向DNA保留在纤维网中；经85 °C、50%相对湿度24 h应力后，选择性仍保持。该工作为化学可寻址、非PCR的DNA存储架构奠定初步基础，提供双层保护、序列非依赖性pH触发选择和未触发区室保留。
关键技术与方法概括：研究人员采用薄膜水合法制备脂质薄膜，经挤出获得SUVs，并以动态光散射（dynamic light scattering, DLS）表征粒径。将DNA负载SUVs混入聚合物溶液，通过电纺形成纳米纤维，并在254 nm UV和二苯甲酮存在下交联聚乙二醇氧化物:三羟甲基丙烷三丙烯酸酯（polyethylene oxide:trimethylolpropane triacrylate, PEO:TMPTA；cPEO）以获得耐水纤维网。释放实验通过顺序浸泡不同pH缓冲液进行，使用引物组PS1/PS2进行PCR扩增和2%琼脂糖凝胶电泳验证，定量PCR（quantitative PCR, qPCR）定量释放DNA，Sanger测序验证序列身份，并进行85 °C、50%相对湿度24 h应力测试。研究未涉及临床样本队列。
研究结果：
SUVs的设计、合成、表征与响应机制（Design, synthesis, characterization and response mechanism of SUVs）：研究人员通过薄膜水合挤出制备中性DMPC:DPPC SUVs对照，DLS显示平均直径102.4 ± 6.8 nm，多分散指数（polydispersity index, PDI）0.042，验证合成方法。空DOPE:CHEMS在酸性pH下尺寸增大约十倍至1669.6 ± 254.7 nm，生理和碱性pH稳定；DSPA:DPPC在酸性和生理pH稳定，碱性pH下直径增至三倍445.6 ± 31.3 nm。结论是DOPE:CHEMS质子化导致DOPE构象变化、脂质融合聚集；DSPA双去质子化增加排斥电荷，破坏囊泡并促进释放。
溶液中SUVs的DNA封装与释放（DNA encapsulation and release from SUVs in solution）：研究人员将消息“Nanogune”和“Textadna”按二进制方案（A:01，T:11，G:10，C:00）重复两次编码为DNA1和DNA2，单链DNA（single-stranded DNA, ssDNA）侧翼引物结合区共112个碱基。DNA1封装于DOPE:CHEMS，DNA2封装于DSPA:DPPC，封装效率分别为91.4%和95.7%。DLS显示负载后尺寸趋势与空囊泡相似；上清PCR和凝胶电泳显示酸性下DNA1扩增，碱性下DNA2扩增。结论是靶向pH条件可实现DNA释放。
SUVs在电纺纳米纤维中的封装（Encapsulation of SUVs in electrospun nanofibers）：研究人员将DNA封装SUVs嵌入电纺纳米纤维，选择耐水PEO:TMPTA（cPEO）在254 nm UV和benzophenone下交联。空DSPA:DPPC在溶液中UV 2 h稳定，纤维耐水。DiO标记中性SUVs的荧光显微镜显示纤维网中荧光宏观较均匀，单纤维尺度异质但空间分散，无宏观聚集。扫描电子显微镜（scanning electron microscopy, SEM）显示平均纳米纤维直径387.9 ± 82.7 nm。结论是SUVs成功嵌入纤维，分布适于宏观选择性检索。
聚合物纤维中SUVs的DNA释放（DNA release from SUVs embedded in polymeric fiber）：研究人员比较中性SUVs嵌入纤维与直接嵌入DNA纤维：PEO-DNA1纤维5 min释放67.7%，24 h室温或37 °C 1 h达98.7%；而DNA-SUVs-PEO纤维在室温24 h或80 °C加热无可测释放，加0.5% Triton X-100破坏SUV后才释放。结论是SUVs提供第二层保护，实现按需释放。
利用正交触发响应SUVs实现分子随机访问（Use of orthogonal trigger-responsive SUVs to achieve molecular random access）：研究人员将两种独立触发响应SUV群体封装在同一cPEO纳米纤维基质。溶液混合对照仅在正确条件释放。干系统两个浸泡循环：pH 7.4→5.5→10和pH 7.4→10→5.5。第一个实验中，pH 7.4无释放；pH 5.5仅PS1扩增，DNA1释放；pH 10时PS1/PS2均扩增，PS2对应DNA2释放，PS1对应残留DNA1，洗涤去除。第二个实验交换顺序：pH 10仅PS2，DNA2释放；pH 5.5时PS2对应残留DNA2，洗涤后PS1对应DNA1释放。qPCR定量显示pH 5.5释放DNA1，pH 10释放DNA2，无模板对照（no-template control, NTC）背景低。Sanger测序确认释放DNA与DNA1/DNA2匹配，无其他片段。结论是pH可寻址控制释放，非靶向DNA保留。
24小时高温应力测试评估系统稳定性（24-Hour high-temperature stress test for system stability evaluation）：在85 °C、50%相对湿度24 h应力后，研究人员使用随机访问实验2（pH 7.4→10→5.5）。凝胶电泳显示pH 7.4无DNA信号，表明SUVs完整。随pH变化，SUVs响应与非应力实验相同，选择性保持，非靶向DNA仍受保护。结论是该系统可适合长期存储和检索，并激励未来工作。
讨论部分总结：该工作为DNA数据存储系统中分子随机访问的PCR非依赖性选择机制提供了概念验证。通过将纳米纤维基质与封装的刺激响应性SUVs结合，研究人员提出通过正交外部触发（pH）靶向DNA序列的检索机制，同时保持系统中其余信息完整。正交性使信息在共享环境中空间和功能区室化，实现受控和顺序选择性访问。DNA封装于纳米囊泡并掺入稳定耐水纤维基质，增强存储平台耐久性和稳定性，提供对机械应力和氧化降解的第二层保护，对温数据存储（warm data storage）至关重要，并减少数据检索对先进外部分选系统的依赖。未来需提高可扩展性和多重化，扩展触发库，如探索pH梯度、将pH响应与脂质温度响应结合、调节聚合物化学性质以创建可编程智能纳米纤维。现阶段多重化潜力低于PCR，但可扩展性可按应用定制。
研究结论翻译：该工作为DNA数据存储系统中分子随机访问的PCR非依赖性选择机制提供了概念验证。通过将纳米纤维基质与封装的刺激响应性SUVs结合，研究人员提出了一种通过正交外部触发（pH）靶向DNA序列的检索机制，同时使系统中其余信息保持完整。借助该系统，研究人员为单个DNA数据文件的物理限制奠定了初步基础，提供了数据存储与完整性的双层保护、序列非依赖性pH触发选择，以及在靶向访问过程中保留未触发区室。由于系统的正交性，信息在共享环境中的空间和功能区室化成为可能，这使得对单个数据集进行受控和顺序选择性访问得以实现。此外，DNA在纳米囊泡中的封装及其掺入稳定耐水纤维基质增强了存储平台的耐久性和稳定性。这实现了对机械应力和氧化降解的第二层保护，对温数据存储至关重要。它还有助于减少数据检索对技术先进的外部分选系统的依赖。为实现完全PCR非依赖性选择基质，该系统的可扩展性和多重化能力至关重要。在本工作中，研究人员提供了使用两个不同正交触发条件的初步概念验证。未来努力将集中于扩展触发库，通过探索pH梯度、将pH响应与脂质的温度响应结合，以及调节所用聚合物的化学性质以创建可编程和智能纳米纤维。在现阶段，尽管该系统尚未提供基于PCR方法所具有的远更高多重化潜力，但其可扩展性可根据预期应用和最终使用需求进行调整。总之，这些结果为迈向化学可寻址和可访问的非PCR基DNA存储架构奠定了初步基础。研究人员开辟了存储更复杂信息以及探索和创建更广泛正交刺激响应性囊泡和纳米材料库的路径。
