NK细胞标志物及杀伤性免疫球蛋白样受体的亚群特异性和组织特异性表达：对NK细胞克隆性评估的启示

《Cytometry Part B: Clinical Cytometry》：Subset-specific and tissue-specific expression of NK-cell markers and killer immunoglobulin-like receptors: Implications for NK-cell clonality assessment

对自然杀伤（NK）细胞肿瘤进行准确的免疫表型评估具有挑战性，因为NK细胞缺乏体细胞重排的抗原受体，由表型不同的亚群组成，并表现出组织特异性的亚群分布。研究人员开发了一个用于NK细胞免疫表型分析和克隆性评估的流式细胞术（FC）检测组合，并将其应用于120份标本，包括正常外周血（PB）、骨髓（BM）、淋巴结（LN）和体液，以及一系列NK细胞肿瘤和意义未明的NK细胞克隆（NK-CUS）。外周血中NK细胞受体（NKR）包括杀伤性免疫球蛋白样受体（KIR，CD158）的表达范围与此前其他研究组报道的结果一致。NK细胞亚群的分布因标本类型而异。虽然PB和BM中的NK细胞以CD56dim亚群为主，但LN和体液标本中CD56bright亚群富集，导致与PB相比CD94/NKG2A表达更高而KIR表达更低。EB病毒（EBV）阳性的NK/T细胞肿瘤表现出相对一致的CD56bright CD16? CD94/NKG2A+ CD57? KIR?免疫表型，类似于正常CD56bright NK细胞，强调了免疫表型异常和散射光特性增加（而非KIR限制性表达）在诊断此类肿瘤中的重要性。NK颗粒淋巴细胞白血病（NK-LGLL）表现出成熟的CD56dim表型并伴有KIR限制性表达。12例病例符合NK-CUS的拟议标准，包括推测与巨细胞病毒（CMV）相关的NK细胞克隆，以及具有更明显免疫表型异常的表型独特的（可能）与CMV无关的克隆。研究人员的发现提示，NK细胞克隆性的解读应考虑NK细胞亚群组成和组织特异性受体表达。这些结果为NK细胞免疫表型分析提供了实践性考量，并有助于更好地理解FC在诊断此类肿瘤中的作用。

论文解读

一、研究背景与意义

NK细胞肿瘤是一组异质性血液系统恶性肿瘤，范围涵盖高度侵袭性疾病如EBV阳性侵袭性NK细胞白血病（ANKL）和结外NK/T细胞淋巴瘤（ENKTL），以及惰性疾病如NK颗粒淋巴细胞白血病（NK-LGLL）。由于NK细胞肿瘤相对少见，血液病理学家通常对其特征性免疫表型不够熟悉。更重要的是，与B细胞和T细胞不同，NK细胞不表达体细胞重排的抗原受体，这使得建立克隆性变得极为困难。这一挑战在NK-LGLL中尤为显著，因为该病与反应性NK细胞扩增在临床和形态学上具有相似特征。尽管STAT3、STAT5b、TET2和CCL22等 recurrent 体细胞突变的发现及其纳入诊断标准显著提高了NK-LGLL的诊断准确性，但这些突变并非在所有病例中均可检出，且全面的基因检测并非在所有机构普遍可用。因此，通过流式细胞术（FC）证明NK细胞受体（NKR）的限制性表达模式已被用作NK-LGLL克隆性的替代标志物。

NK细胞可根据CD56和CD16表达水平分为两个主要亚群：CD56^bright CD16^dim/negative（简称CD56^bright）亚群占循环NK细胞的5%–10%，主要参与细胞因子/趋化因子产生，细胞毒能力有限；CD56^dim CD16^bright（简称CD56^dim）亚群占循环NK细胞的大多数，更为成熟且具有高细胞毒能力。杀伤性免疫球蛋白样受体（KIR）是表达于NK细胞表面的抑制性和激活性受体家族，与HLA I类分子结合并调节NK细胞对感染和恶性细胞的应答。CD56^bright NK细胞上KIR表达基本缺失，而CD56^dim NK细胞在成熟过程中获得随机且克隆性稳定的KIR库。健康个体中大多数NK细胞表达一种至数种KIR，形成多克隆表达模式。既往研究虽建立了CD158a、CD158b、CD158e、KIR阴性和NKG2A表达的99%参考区间（RIs）并证明这些阈值能很好地区分NK细胞肿瘤与健康个体的NK细胞，但缺乏对CD56^bright与CD56^dim亚群受体表达模式的详细分析，也未研究其他标本类型中的亚群分布和受体表达模式。

二、主要技术方法

研究人员开发了一个12色多参数FC检测组合，用于表征正常外周血（PB）、骨髓（BM）、淋巴结（LN）和体液标本中的NK细胞亚群组成和NKR表达。研究队列共120份标本，其中67份来自无血液淋巴系统肿瘤或其他恶性肿瘤证据的患者，用于建立正常NK细胞亚群分布和受体表达模式，包括32份PB、14份BM、11份LN和10份体液标本。所有病例均使用T细胞筛查组合和NK细胞反射检测组合进行分析，后者包含CD94、NKG2A以及三种常用KIR（CD158a、CD158b和CD158e）。数据分析在Woodlist 3.1.2软件上完成，统计分析使用Prism 8，数值变量采用双尾Mann-Whitney U检验比较，p≤0.05为差异有统计学意义。

三、研究结果

正常PB中NK细胞组成和标志物表达。 研究人员首先利用32份PB标本验证了此前报道的KIR和NK细胞标志物表达参考区间。PB NK细胞由较小的CD56^bright亚群和较大的CD56^dim亚群组成。CD56^bright亚群特征为NKG2A/CD94异二聚体的明亮均一表达以及CD57和KIR的缺失，而CD56^dim亚群表现为CD94/NKG2A的可变表达、CD8和CD57的异质性表达以及多型KIR。从CD56^bright向CD56^dim亚群的转变伴随CD45增加和CD7轻微降低，以及CD94/NKG2A表达的可变丢失和CD57及KIR的获得。由于KIR常用于评估NK-LGLL的克隆性，而该病主要呈CD56^dim免疫表型，研究人员专门为此亚群建立了表达水平，发现与总NK细胞群观察到的数值相当。

不同标本类型中NK细胞亚群分布。 通过分析14份BM、11份LN和10份体液标本，研究人员发现BM中NK细胞亚群分布与PB大体相似，以CD56^dim亚群为主，但少数病例显示CD56^bright亚群相对增加。相比之下，LN和体液标本中CD56^bright亚群比例较高，导致这些标本中CD94/NKG2A表达增加而KIR表达降低。NK细胞在LN标本中的频率（1.3%±0.7%）明显低于PB（10.8%±7.0%）和BM（14.1%±6.5%），而体液标本（14.8%±16.0%）显示显著变异性。

EBV阳性NK/T细胞肿瘤的免疫表型特征。 研究人员识别了来自12例患者的16例EBV阳性NK/T细胞肿瘤，包括10例ENKTL和6例ANKL。筛查组合中最常见的异常包括CD56明亮表达、FSC和SSC增加以及CD7表达降低至缺失。反射检测显示所有病例均缺乏CD16表达，大多数病例CD94/NKG2A异二聚体阳性，CD8和CD57均阴性，所有病例均缺乏KIR表达。重要的是，EBV阳性NK/T细胞肿瘤的免疫表型类似于正常CD56^bright NK细胞亚群，强调了免疫表型异常和散射光特性增加在诊断和随访此类肿瘤中的重要性。

NK-LGLL的免疫表型特征。 4例诊断为NK-LGLL的病例中，3例满足WHO诊断标准。所有病例在筛查组合中显示CD56降低至缺失、CD7降低和CD2表达保留。反射检测显示CD8、CD16和CD57的可变表达，3例CD94和NKG2A阳性，所有病例均显示KIR限制性表达，其中2例显示双克隆性，1例为KIR阴性。淋巴样NGS研究在3例中检出STAT3和TET2突变。NK-LGLL病例提供了对比性示例，即NKR限制性表达发生在以成熟CD56^dim NK细胞为主的群体中，支持在NK细胞亚群组成背景下评估受体限制性的重要性。

NK-CUS的识别与分型。 12例病例携带不符合NK-LGLL诊断标准的小克隆NK细胞群体，被分类为NK-CUS，克隆频率范围为0.1%至7.4%。根据免疫表型，这些病例可分为两个亚组：7例携带提示与当前或既往CMV感染相关的克隆扩增的NK细胞克隆，这些克隆通常通过部分CD5表达（伴或不伴CD7降低）在筛查组合中被识别，CD57阳性并显示KIR限制性表达模式；4例携带免疫表型特征不同于CMV相关克隆的NK细胞克隆，表现出更明显的异常，主要涉及CD7和/或CD56的丢失或降低。一般而言，推测与CMV无关的NK-CUS病例比推测与CMV相关的病例表现出更明显的免疫表型异常，且占NK细胞的比例更大（5.0%±1.9% vs. 1.9%±2.0%，p=0.03）。随访期间，无一例患者发展为进行性淋巴细胞增多或NK细胞肿瘤。

四、讨论与结论

研究人员提出，NK细胞克隆性和KIR限制性的解读应考虑所分析的具体NK细胞亚群，这在KIR阴性被用作克隆性证据时尤为重要。由于CD56^bright NK细胞在正常情况下基本为KIR阴性，该亚群的扩增可增加总NK细胞群体中KIR阴性细胞的比例，在异基因造血干细胞移植后早期免疫重建或IL2/IL15免疫治疗等情况下，KIR阴性NK细胞频率增加可能被误判为克隆性证据。

NK细胞亚群组成在不同标本类型间差异显著。LN和体液标本中CD56^bright亚群富集，导致CD94/NKG2A表达升高和KIR阴性NK细胞比例增加。在生理性富集CD56^bright NK细胞的标本中，CD94/NKG2A表达增加和KIR阴性应在亚群组成背景下解读，不应孤立地视为异常或克隆性NK细胞群体的证据。

EBV阳性NK/T细胞肿瘤表现出相对保留的CD56^bright CD16^? CD94/NKG2A⁺ CD8^? CD57^? KIR^?免疫表型，与正常CD56^bright NK细胞亚群极为相似。由于正常CD56^bright NK细胞生理性为KIR阴性，KIR阴性不应被解释为这些肿瘤的克隆性证据，这在微小残留病（MRD）评估中尤为重要。

NK-LGLL的诊断有时具有挑战性，因为合并症可能导致NK细胞淋巴细胞增多、临床随访有限和诊断评估不完整。多种情况包括急慢性病毒感染、自身免疫性疾病和达沙替尼等药物均可诱导具有非典型免疫表型特征或明显KIR限制性的NK细胞扩增。对于表现为KIR限制性NK细胞淋巴细胞增多的患者，在排除潜在反应性原因并整合额外克隆性或肿瘤证据（如NGS检出的复发突变、骨髓异常或持续不明原因的细胞减少）后，再确立NK-LGLL诊断可能更为审慎。

NK-CUS是一个新认识且不断演变的实体。研究人员的发现结合既往研究提示，这些克隆可能在不同的临床背景下产生，可能代表生物学异质性群体。对NK-CUS的更全面理解需要更大患者队列和更长临床随访的研究。

总之，研究人员的发现支持以下建议：第一，NK细胞免疫表型的准确解读和克隆性评估需要理解正常NK细胞亚群分布及每个亚群内的受体表达模式；第二，由于NK细胞亚群组成在不同组织类型间差异显著，为PB建立的参考区间不应不加区分地应用于其他标本类型；第三，当KIR阴性被用作克隆性证据时应谨慎，特别是在评估CD56^bright NK细胞群体或分析PB和BM以外组织部位的标本时；第四，NK-CUS是新认识且不断演变的实体，可能代表生物学异质性群体。