pH/葡萄糖双响应苯硼酸功能化无规三元共聚物 p(HEMA-PBA-co-HEMA-co-DMAEMA) 用于智能控制胰岛素递送

《Macromolecular Materials and Engineering》：Multiresponsive Random Terpolymers Based on Phenylboronic Acid for Smart Controlled Insulin Delivery

pH和葡萄糖响应的基于4-羧基苯硼酸修饰的甲基丙烯酸2-羟乙酯（HEMA-PBA）、甲基丙烯酸2-羟乙酯（HEMA）和甲基丙烯酸2-(二甲氨基)乙酯（DMAEMA）的无规三元共聚物 p(HEMA-PBA-co-HEMA-co-DMAEMA) 通过可逆加成-断裂链转移（RAFT）聚合合成。研究人员以三种不同DMAEMA含量（20、30和40 mol. %）和苯硼酸（PBA）部分（20、15和10 mol. %）制备三元共聚物，以研究组成对物理化学和响应行为的影响。FT-IR、¹H NMR和GPC证实成功合成具有窄分子量分布（M_w/M_n ～1.18-1.19）的明确结构三元共聚物。由pH滴定和光谱差示分析获得的pK_a值随DMAEMA含量增加而降低，可能由于氨基的存在改变了局部环境并增强了三元共聚物的表观酸性。动态光散射（DLS）表明由可逆二醇-硼酸酯络合驱动的pH依赖性聚集和葡萄糖敏感性解组装。所有样品中胰岛素包封显示出高于91%的高负载效率。此外，使用HFF-2成纤维细胞进行的细胞毒性评价证实了优异的生物相容性，对于未负载和胰岛素负载三元共聚物，即使在高浓度下细胞活力仍保持在～75%。

论文解读

糖尿病已成为全球最重要的健康威胁之一，需要终身治疗以将血糖调节在正常范围（70-100 mg/dl）并预防急性并发症。目前，每日注射胰岛素是管理胰岛素依赖型糖尿病最有效的治疗方式，但会给患者带来较大负担。因此，迫切需要探索能够根据血糖水平进行自我调节胰岛素递送的替代糖尿病管理策略。近年来，葡萄糖响应材料受到关注，例如含苯硼酸（PBA）的聚合物、葡萄糖氧化酶（GOD）系统和Concanavalin A（CON A）修饰系统，已用于自调节胰岛素递送系统和多种生物传感器。CON A和GOD是已知的葡萄糖响应生物材料，但存在蛋白变性和随时间丧失活性的问题。相反，含PBA的合成材料可形成与葡萄糖的可逆共价键和硼酸酯，用于稳定的葡萄糖响应系统，增强控制胰岛素释放并改善糖尿病护理。虽然PBA结构本身对葡萄糖并不天然具有选择性，但通过加入胺、羧酸或硫醇基团精细调节pK_a可改善葡萄糖选择性。在共聚单体中，HEMA因PHEMA基材料良好的生物相容性、亲水性和化学稳定性，特别适用于生物医学和药物递送应用；DMAEMA通过叔胺基团引入pH响应性；将PBA引入共聚物结构可赋予与二醇如葡萄糖的特异相互作用。前人研究中，Ghashghaei Zadeh et al. 合成了葡萄糖和pH响应的p(HEMA-CPBA)，考察不同分子量对表观pK_a、包封效率和释放动力学的影响；Jiang et al. 开发了由p(DMAEMA-co-APBA)组成的多刺激响应胶束；Narinesingh et al. 研究了p(HEMA-co-DMAEMA)的pH响应药物递送。该研究关注设计、合成和表征随机三元共聚物p(HEMA-PBA-co-HEMA-co-DMAEMA)，通过RAFT聚合制备三种不同单体组成，以研究阳离子单体DMAEMA和HEMA-PBA的PBA部分对三元共聚物酸碱平衡的影响，并探索利用pH滴定和光谱差示技术调节pK_a、优化生理条件下葡萄糖响应性，进一步考察胰岛素包封、双响应释放行为和细胞毒性，以展示其作为具有高包封效率和优异生物相容性的智能胰岛素递送系统的潜力。

研究人员通过RAFT（可逆加成-断裂链转移）聚合合成三种三元共聚物TP A、TP B和TP C，DMAEMA含量分别为20、30和40 mol.%，PBA部分分别为20、15和10 mol.%。研究得出，三元共聚物具有明确分子量、窄分散度和组成依赖的酸碱行为，可系统调节pK_a。pH滴定和光谱差示分析均证实，增加DMAEMA含量可通过促进质子化诱导的硼酸根稳定降低表观pK_a，从而增强生理相关条件下的响应性。三元共聚物表现出由pH和葡萄糖浓度调控的独特且可逆自组装行为。PBA和DMAEMA含量强烈影响聚集-解组装转变、葡萄糖触发络合以及流体动力学直径和zeta电位的相应变化。所有三元共聚物均显示优异的胰岛素包封效率（>91%），胰岛素释放随葡萄糖浓度增加而增加。使用HFF-2成纤维细胞进行细胞毒性评价显示良好细胞相容性。该研究的意义在于提供一种可调pK_a、葡萄糖响应、高包封且生物相容的胰岛素递送平台；但所开发三元共聚物的有限降解性是重要限制，尤其对于系统性或长期给药，其降解、体内生物分布、清除和长期安全仍需进一步评价。

关键技术方法（不超过250字）：研究人员采用RAFT聚合合成p(HEMA-PBA-co-HEMA-co-DMAEMA)，通过调节单体投料制备TP A、TP B和TP C。用FT-IR（傅里叶变换红外光谱）、¹H NMR（核磁共振氢谱）和GPC（凝胶渗透色谱）表征结构与分子量。用pH滴定和Gorman-Darnall光谱差示法测定pK_a。用UV-vis（紫外-可见光谱）和DLS（动态光散射）评价pH/葡萄糖响应性、粒径和zeta电位。用透析法进行胰岛素包封和体外释放，并以UV-vis 595 nm定量。用HFF-2（人包皮成纤维细胞）和MTT法评价未负载及胰岛素负载三元共聚物的细胞毒性。未涉及临床样本队列。

研究结果：

3.1 Characterizations：通过¹H NMR、FT-IR和GPC确认TP A、TP B和TP C成功合成。FT-IR显示O─H/B─OH、C─H、C═O、芳环C═C、C─O、C─N和B─O等特征吸收。NMR估算DP_n分别为74、68和73，组成分别为p[(HEMA-PBA)₁₂-co-(HEMA)₄₈-co-(DMAEMA)₁₄]、p[(HEMA-PBA)₁₃-co-(HEMA)₄₀-co-(DMAEMA)₁₅]和p[(HEMA-PBA)₇-co-(HEMA)₃₈-co-(DMAEMA)₂₈]。GPC得数均分子量（M_n）为10100、10400和10600 g/mol，分散度（D）分别为1.18、1.18和1.19，与理论值和NMR值一致，表明RAFT过程可控。

3.2 Measurement of pK_a：通过pH滴定曲线和光谱差示法测定pK_a。pH滴定显示TP A、TP B和TP C的pK_a分别为7.8、7.6和7.4，随DMAEMA比例增加而降低，因质子化基团增加使聚合物链正电荷升高并降低三元共聚物pK_a。光谱差示法显示PBA从电中性三角形式向带负电四面体硼酸根形式转变；DMAEMA质子化通过静电相互作用稳定硼酸根，DMAEMA含量增加使电离在较低pH发生并较早达到饱和。

3.3 pH-responsivity of p(HEMA-PBA-co-HEMA-co-DMAEMA)：DLS显示pH约7时TP A、TP B和TP C的流体动力学直径（D_H）分别约为742、395和517 nm，因DMAEMA叔胺质子化增加正电荷和链间静电排斥，使链尺寸较小。pH 7.6接近pK_a时，粒径增至约785、568和636 nm，因DMA去质子化减弱静电排斥并促进聚集。pH约9接近PBA的pK_a时，硼酸根去质子化赋予负电荷并增强排斥，粒径降至约535、453和418 nm，表明pH依赖的可逆聚集/解组装。

3.4 Glucose Responsivity of p(HEMA-PBA-co-HEMA-co-DMAEMA)：PBA与葡萄糖的可逆相互作用赋予葡萄糖响应性。UV-vis显示在pH 7.0-9.0和1、3、5 mg/mL葡萄糖下，TP A具有最高葡萄糖敏感性；DMAEMA从20%增至40%会降低葡萄糖响应性，因HEMA-PBA含量下降。DLS和zeta电位显示自组装-解组装取决于葡萄糖浓度和pH。TP A和TP B在葡萄糖从1增至3 mg/mL时粒径显著增加，5 mg/mL时略有降低，归因于PBA结合位点饱和和负电荷增加导致静电排斥。TP C因PBA最低、DMAEMA最高，葡萄糖-PBA结合有限，粒径随葡萄糖增加主要因表面电荷变化和DMAEMA质子化降低、静电排斥减少而聚集。由zeta电位-pH曲线估算表观等电点（IEP）为TP A 7.17、TP B 7.17和TP C 7.36；葡萄糖结合通常使zeta电位向更负值移动，高pH和高葡萄糖浓度下更明显，PBA含量增加增强负移，DMAEMA增加缓和负移。

3.5 Insulin Loading and Release of p(HEMA-PBA-co-HEMA-co-DMAEMA)：胰岛素包封受氢键、亲水-疏水作用、物理包埋、胰岛素吸附以及三元共聚物中硼酸根结合位点可用性共同影响。载药量（LC）和包封效率（EE）分别为TP A 0.118 mg/mg和94.4%、TP B 0.115 mg/mg和92.4%、TP C 0.112 mg/mg和91.8%。高包封效率归因于多价相互作用：DMAEMA在生理pH部分质子化，对带负电胰岛素产生静电吸引；PBA与胰岛素羟基发生可逆硼酸酯-二醇络合，并提供PBA苯基与胰岛素芳香侧链的π-π堆积。体外释放24 h、37°C、pH 7.4条件下，所有样品前1.5 h无突释。无葡萄糖时TP A、TP B和TP C释放约3.5%、2%和1%。葡萄糖增加加速释放：TP A在1、3、5 mg/mL下约35%、55%和67%；TP B约20%、40%和55%；TP C约17%、26%和47%。TP A释放最高，TP C释放较慢，因DMAEMA含量高提供更强静电和氢键结合。

3.6 Cytotoxicity and Cell Viability of p(HEMA-PBA-co-HEMA-co-DMAEMA)：用HFF-2细胞MTT法在25-400 μg/mL、48 h下评价。未负载和胰岛素负载TP A、TP B、TP C均显示良好细胞相容性，未负载三元共聚物在400 μg/mL下细胞活力仍>75%。胰岛素负载使细胞活力平均降低约6%，未显著损害三元共聚物制剂的细胞相容性。TP A和TP B比TP C略高生物相容性；TP C DMAEMA含量高，生理pH下叔胺部分质子化增加正电荷，虽增强胰岛素静电包封，但促进与带负电细胞膜的非特异相互作用，破坏膜完整性并在高浓度触发细胞死亡。

最后，讨论部分指出，该研究为概念验证研究，聚焦聚合物合成、理化表征、葡萄糖和pH响应性、胰岛素负载和控释。所开发三元共聚物的有限降解性是重要限制，尤其对于系统性或长期给药；聚合物降解、降解产物、体内生物分布、清除和长期安全未系统研究，因此需要进一步评价，未来研究这些方面对建立该响应性胰岛素递送平台的长期生物学命运和转化潜力至关重要。

研究结论部分翻译：在本研究中，研究人员通过RAFT聚合成功合成一系列多响应随机三元共聚物p(HEMA-PBA-co-HEMA-co-DMAEMA)，具有可调DMAEMA和HEMA-PBA比例，用于构建智能胰岛素递送平台。聚合物表现出明确分子量、窄分散度和组成依赖的酸碱行为，可系统调节pK_a。pH滴定和光谱差示分析均证实，增加DMAEMA含量通过促进质子化诱导的硼酸根稳定降低表观pK_a，从而增强生理相关条件下的响应性。三元共聚物表现出由pH和葡萄糖浓度调控的独特且可逆自组装行为。PBA和DMAEMA含量变化强烈影响聚集-解组装转变、葡萄糖触发络合以及流体动力学直径和zeta电位相应变化。样品中，PBA含量最高的TP A表现出最显著葡萄糖敏感性和最大结构转变，而DMAEMA比例较高的TP C葡萄糖响应性降低。所有三元共聚物均显示优异胰岛素包封效率（>91%），归因于胰岛素与聚合物链之间氢键、静电相互作用和可逆硼酸酯-二醇结合的协同作用。胰岛素释放随葡萄糖浓度逐渐增加，反映胰岛素和葡萄糖对硼酸根位点的竞争性结合。TP A提供最灵敏释放行为，而TP C因生理pH下与胰岛素更强静电相互作用释放较慢。用HFF-2成纤维细胞对未负载和胰岛素负载TP A、TP B和TP C的细胞毒性评估显示良好细胞相容性，测试浓度下细胞活力保持>75%。胰岛素负载仅轻微降低细胞活力，表明胰岛素引入未显著损害三元共聚物制剂的细胞相容性。所开发三元共聚物的有限降解性是重要限制，需在其未来生物医学应用中考虑，尤其系统性或长期给药。本工作设计为概念验证研究，聚焦聚合物合成、理化表征、葡萄糖和pH响应性、胰岛素负载和控释。聚合物降解、降解产物、体内生物分布、清除和长期安全未系统研究，因此需要进一步评价。未来研究这些方面对建立该响应性胰岛素递送平台的长期生物学命运和转化潜力至关重要。