当蛋白质靶向失败：SRP通路与造血障碍

《Seminars in Hematology》：When Protein Targeting Fails: SRP Pathway and Hematopoietic disorders

**摘要**

信号识别颗粒（SRP）和SEC61易位子协同介导分泌蛋白和膜蛋白的共翻译靶向定位至内质网，这一过程日益被确认为正常粒细胞生成和骨髓功能的关键环节。SRP亚基、SRP受体和SEC61的种系突变定义了一组严重的先天性中性粒细胞减少症和遗传性骨髓衰竭综合征，这些疾病的驱动机制在于蛋白质靶向定位和内质网稳态的破坏。本文综述了这些突变的结构和机制后果，将其与特征性临床表型联系起来，并突出了将塑造SRP相关疾病诊断和治疗的最新概念和未解决问题。

**引言**

信号识别颗粒（SRP）是一种细胞质核糖核蛋白，它结合新暴露的信号肽/核糖体翻译复合物，在蛋白质翻译和转运中发挥核心作用[1]。尽管其生物学鉴定早在20世纪80年代初就已确立，但SRP复合物在人类疾病中的作用是较近才被表征的。人类病理学中SRP种系异常的首份报告发表于2012年[2]。在两个易患骨髓增生异常综合征和耳聋的家庭中观察到了SRP72基因的缺陷，在此之前有轻度无症状性中性粒细胞减少。2017年，在一例具有Shwachman-Diamond综合征（SDS）特征的患者中鉴定出SRP54基因突变[3]。随后的报告鉴定了：一例SCN患者中的SRP68双等位基因变异[4]、一例SCN患者中编码SEC61α易位子亚基的SEC61A1杂合变异[5]，以及在具有先天性中性粒细胞减少症和SDS样特征的患者中SRP19和SRPRA的致病性变异。总体而言，这组疾病仅占先天性中性粒细胞减少症患者的一小部分（法国SCN登记中不超过2%）以及遗传性骨髓衰竭综合征（IBMFS）的一小部分。然而，它们的存在为一种非常独特的病理生理机制提供了宝贵的见解，本文对此进行了概述。

在真核生物中，SRP复合物介导分泌蛋白和膜蛋白的共翻译靶向定位和转位。SRP组分（SRP19、SRP54、SRP68、SRP72和SEC61的A1亚基）中的先天性突变损害了共翻译靶向定位，并与遗传性骨髓衰竭综合征相关，包括严重先天性中性粒细胞减少症（SCN）、SDS样表型和家族性再生障碍性贫血/骨髓增生异常综合征[7]。尽管SRP广泛存在，但中性粒细胞谱系细胞尤其敏感，这也是该疾病表型的基础。

SRP是一种核糖核蛋白复合物，在高等真核生物中通过将新生肽链共翻译递送至内质网（ER）而将蛋白质合成与膜靶向偶联[[8], [9], [10], [11], [12]]。该复合物与核糖体相互作用，负责识别含有信号序列的新生多肽、携带信号序列的核糖体的延伸停滞，以及核糖核蛋白复合物向内质网的转位（图1）。易位子是内质网SEC61复合物及其相关因子，形成进入细胞分泌途径的主要门户。当SRP缺失或未能识别信号肽时，一条称为异常蛋白质生成调节（RAPP）的质量控制通路被激活，导致相应mRNA的选择性降解和蛋白质质量控制系统的压力增加[13]。

SRP由沿7SL RNA的两个主要核蛋白结构域组成[14]。Alu结构域（SRP9和SRP14蛋白）通过结合核糖体的延伸因子位点介导翻译延伸停滞，暂时置换eEF1/eEF2，使肽合成暂停。S结构域（包括7SL RNA上的SRP19、SRP54、SRP68和SRP72结合位点）识别核糖体新生链上的信号序列，并将复合物引导至内质网膜上的信号识别颗粒受体（SR）[15]。SRP54与7SL RNA一起构成SRP的最小功能核心，并介导携带信号肽的核糖体向SEC61易位子的交接[16,17]。SRP54由三个结构域组成：N（N端）、G（GTP酶）和M（富含甲硫氨酸）。N和G结构域形成保守的NG模块，介导SRP受体结合和GTP水解，而M结构域结合信号肽并接触SRP RNA[10]。M结构域在序列上相对分歧，仅在组装好的SRP复合物中完全有序[16,18,19]。SRP54-SRα相互作用的遗传和结构研究表明，这种NG-M架构和受体结合模式在不同门类中具有惊人的保守性[20]。

SRP19、SRP68和SRP72主要负责与SRP 7SL RNA结合并组装SRP复合物[21,22]。这些蛋白与S结构域相互作用。SRP72/SRP68以异二聚体复合物形式结合。SRP9/SRP14也形成紧密异二聚体，结合7SL RNA的Alu结构域[23]。SRP9/14-Alu复合物构成SRP的延伸停滞结构域。

SRP受体由内质网膜整合型β亚基（SRβ）和外周细胞质α亚基（SRα）组成。SRα的细胞质NG结构域与SRP54互补的NG结构域形成GTP依赖性复合物。这一异二聚体共同识别新生多肽上的信号序列并形成初始靶向复合物。SRP54-SRα随后与内质网膜上的SEC61易位子相互作用，以促进新生链插入内质网。SRP54的GTP酶活性驱动膜对接和随后SRP释放的循环。

信号识别颗粒（SRP）途径的先天性突变已知会导致血液学疾病，最常见的是中性粒细胞减少和骨髓功能障碍[[24], [25], [26], [27], [28]]。遗传性骨髓衰竭综合征以造血谱系之一或多个谱系的产生受损为特征，并作为癌症易感综合征发挥作用，儿童骨髓增生异常综合征和急性白血病的风险显著增加[2,29]。

在目前已知的SRP54变异中，具有显性负性效应的杂合突变似乎最常见。这些变异与严重先天性中性粒细胞减少症相关，有时伴有外分泌胰腺功能不全，如在SBDS基因突变导致的SDS中所观察到的。文献中共报道了53例患者，如表1所述。外分泌胰腺缺陷的存在可导致生长迟缓、脂溶性维生素缺乏、慢性腹泻（如SBDS SDS中），以及与发育迟缓相关的神经认知模式，这在SBDS相关综合征中也可见到。

然而，SRP54 SCN与SBDS SDS的血液学特征却截然不同。中性粒细胞减少更为严重，常低于500/mm3，伴有髓系成熟阻滞。大多数报告的患者接受了粒细胞集落刺激因子（G-CSF）治疗（约80%），但约20%的报告病例尽管G-CSF剂量> 30 μg/kg/天，仍未能使中性粒细胞升高。这种血液学模式与经典的SBDS血液学特征大相径庭：轻度中性粒细胞减少、无成熟阻滞，骨髓中无髓系阻滞但伴有异形粒细胞生成特征。在SBDS SDS中，G-CSF通常低剂量即可有效[30]。总体而言，SRP54的血液学模式更接近于ELANE型SCN的轮廓[31]，而非SBDS轮廓。当SRP54患者中报告出现白血病时[29]，其风险（1/45例可评估病例）低于SBDS患者中观察到的风险。造血干细胞移植相对频繁（45例可评估患者中9例），主要由于G-CSF失效或感染（n=8），而非白血病（n=1）。此外，在45例可评估患者中有11例观察到与胰腺功能不全及神经认知困难相关的关联，约为三分之一。

与SCN相关的人类SRP54基因先天性突变位于NG结构域（图1C）。已知的突变包括Gly111Trp、Gly113Arg、Thr115Ala、Thr117del、Cys118Tyr、Cys136Tyr、Ala223Asp、Gly226Glu和Gly274Asp（图2A）[32]。Thr117缺失是最常见的，见于约60%的患者，似乎负责几乎纯血液学表现，而G2、G3和G4结构域中的突变则与SBDS SDS特征相关。SRP54中的先天性突变影响蛋白质合成和转运，或触发未折叠蛋白反应和内质网（ER）应激，最终破坏粒细胞生成[3,33]。

迄今为止报道的SRP54突变映射到该酶的保守区域（图2）。其中，Thr115Ala、Thr117del和Gly226Glu已通过结构和功能分析进行表征。所有突变均映射到SRP54的NG结构域。这些突变的分子基础最近通过使用包括蛋白质X射线晶体学、质谱法和生物物理方法在内的分析技术进行了探究[34,35]。

Thr117del和Thr115Ala突变位于GTP酶活性位点附近，这些改变影响辅因子结合和催化。结构和生物化学分析表明，这些突变降低了结构稳定性，导致辅因子结合和催化功能异常，以及与SRP受体复合物相互作用受损[34]。Gly226Glu位于SRP54活性位点的远端，处于SRP54和SRα的NG结构域异二聚体界面处。据推测，这种改变影响了SRP-SRα复合物的稳定性和该途径的GTP依赖性周转[35]。该突变可以以显性负性方式发挥作用，导致靶向复合物在早期构象状态中积累，阻止SRP-核糖体预交接复合物的形成。已使用体内模型来深入了解SRP54突变的功能作用[25]。在斑马鱼模型中，过表达SRP54突变体（Thr115Ala、Thr117del和Gly226Glu）在野生型斑马鱼中引起了中性粒细胞减少表型和胰腺异常[3]。这些突变损害了斑马鱼XBP1基因的剪接，模拟了SRP54缺陷表型[36]。此外，这些SRP54突变体的显性负性样效应在人体组织培养细胞模型中也有记录[[33], [34], [35]]。功能受损的突变体可以与内源性野生型SRP54竞争SRP组装，导致不恰当的共翻译靶向定位、异常ER应激和XBP1剪接受损。

SRP68和SRP72形成异二聚体，结合7SL RNA的S结构域并稳定SRP的S结构域[21]。该复合物参与SRP/核糖体相互作用，对于高效的共翻译靶向定位和转位是必需的（图2B）。该蛋白含有N端RNA结合结构域（RBD）和结合SRP72凹槽基序的C端区域。SRP68的双等位基因突变已被报道可导致常染色体隐性SCN[4]。具体的SRP68突变是一个剪接位点突变和1外显子缺失，共同导致SRP68表达降低。功能研究表明，粒细胞前体细胞和中性粒细胞中出现诱导的ER应激和TP53依赖性凋亡增加，反映了先天性中性粒细胞减少症特征性的成熟阻滞。

仅报告了1例携带杂合SRP68基因型的患者[c.184+2T>C];[1外显子缺失][4]。该独特患者是一名高加索男孩，在6周大时因肛周脓肿就诊。血细胞计数显示严重中性粒细胞减少（白细胞6100/mm3，中性粒细胞200/mm3，单核细胞计数升高（1700/mm3），伴有铁缺乏性贫血（血红蛋白7.5 g/dL）和中度血小板减少（血小板149,000/mm3）。连续血细胞计数（n=41）确认了持续且严重的中性粒细胞减少（200/mm3 [0-1,800]）。在生命的第一年内，严重贫血（主要在前3个月）和血小板减少相关联，随后在患者随访中恢复。骨髓检查显示早幼粒细胞阶段的成熟阻滞和显著的异形粒细胞生成特征。从诊断到7岁时最后一次随访，他接受了预防性抗生素治疗和粒细胞集落刺激因子治疗（5至10 μg/kg/天）。

SRP72基因的多个突变案例已链接到遗传性骨髓衰竭综合征[37]。已报道的变异分布在SRP72蛋白各处。SRP72蛋白由两个结构域组成，其间隔以一个被认为发挥调节作用的无序区域。N端蛋白结合结构域（PBD）（残基约10-160）形成结合SRP68的凹槽，形成SRP68/72异二聚体。与SRP68一样，SRP72含有一个RNA结合结构域（RBD，残基约552-561），结合7SL SRP RNA。在PBD和RBD之间是一个主要无序区域，含有参与调节SRP72稳定性和活性的位点，包括在凋亡和信号转导期间。在C端极端处，已鉴定出修饰SRP72在这些调节背景中功能的半胱天冬酶切割和磷酸化位点[38]。

SRP72基因中发现与骨髓衰竭综合征相关的突变示例（表2）包括：导致Leu502位置蛋白截短的突变体（移码）[37]、Trp474（无义）[27]和Thr355（移码）[2]、Ile481（移码）[39]，以及错义突变：Arg207His [2]、Ala2Val [40]、Pro257Arg [40]和Thr483Asn [40]。其他示例包括与SBDS基因的复合杂合突变。SRP72杂合小鼠未能重现人类患者中观察到的完整血液学异常谱，提示种间存在剂量敏感性或代偿机制的差异[41]。总体而言，错义突变并不聚集在SRP72的结构有序结构域中（图2B）。

相反，它们位于大的跨结构域区域，表明它们主要影响调控相互作用和/或整体蛋白稳定性。迄今为止描述的移码突变产生截短的蛋白质，缺乏C端RBD结构域，这与SRP72结合7SL RNA的能力丧失相一致。SRα是SRP受体的细胞质对接结构域，含有一个与SRP54同源的NG型GTP酶结构域。该结构域是内质网靶向和核糖体-转位子复合物形成的关键（图1）。Klein及其同事的一项报告鉴定了SRPRA基因中的一个杂合错义突变，对应Gln464替换为Glu [6]。该突变位于SRα的GTP酶活性位点附近，天然残基与GTP的γ-磷酸和/或水合Mg2?/GDP复合物形成氢键相互作用。SRP54的NG结构域中的同源位置是保守的，并参与与GTP辅因子的类似相互作用。该病例患者出现发育不良和反复肺部感染。她表现为生长障碍、支气管扩张、胰腺功能不全以及骨髓中髓系成熟阻滞相关的先天性中性粒细胞减少症，最终死于感染。总体而言，其表型与其他SRP54表型相似。在同一研究中，在两个家庭的五名受累个体中鉴定出SRP19的纯合剪接位点变异。患者表现为孤立的严重中性粒细胞减少症，类似于ELANE表型。对于SRPRA和SRP19，作者利用患者样本、诱导多能干细胞衍生模型和小鼠验证了这些变异在先天性中性粒细胞减少症中的致病作用。他们的数据表明，这些突变汇聚于一个共享机制，涉及内质网应激、颗粒蛋白加工缺陷以及粒细胞前体细胞凋亡。SEC61是内质网膜中的中央蛋白转位通道（转位子），负责大多数分泌蛋白和膜蛋白的共翻译转位，同时作为重要的内质网钙漏通道发挥作用（图1）。SEC61A1编码SEC61α亚基，其杂合突变已知会导致常染色体显性遗传性疾病，特征为蛋白转位受损、内质网Ca2?泄漏增加、内质网应激和粒细胞生成缺陷[42]。最近报道了在一名慢性严重中性粒细胞减少症且伴有髓系阻滞、无伴随合并症的患者中鉴定并表征了一种导致SCN的SEC61A1错义突变 [5]。该突变Gln92Arg降低了SEC61α蛋白水平，从而影响蛋白转位，并增加了内质网腔的Ca2?泄漏。人类SEC61α中的Gln92位于跨膜螺旋2（TM2）内，该区域与通道门控和Ca2?离子外流有关。除了与SCN相关的Gln92Arg外，Val67Gly SEC61A1突变被报道表现为常染色体显性遗传小管间质性肾病表型，包括2型糖尿病、免疫缺陷、小管间质性肾病和中性粒细胞减少症 [43]。两种突变均定位于SEC61α亚基的10次跨膜核心，该核心构成SEC61转位子复合物的中央蛋白转位孔（图2C）。章节摘要结论SRP通路和SEC61转位子的遗传缺陷定义了一个独特的骨髓衰竭综合征亚集，其特征为共翻译靶向受损和内质网稳态失调（图3）。SRP组分、SRP受体和SEC61中的致病突变损害了分泌蛋白和膜蛋白向内质网的共翻译递送，导致中性粒细胞颗粒蛋白加工缺陷、内质网应激和未折叠蛋白反应通路激活。利益冲突声明作者没有需要披露的利益冲突。CRediT作者贡献声明Steven D. Bruner：撰写—审阅与编辑，撰写—初稿。Jean Donadieu：撰写—审阅与编辑，撰写—初稿。Manon Delafoy：撰写—审阅与编辑，撰写—初稿。Ming Yang：撰写—审阅与编辑，撰写—初稿。利益冲突声明作者声明没有已知的竞争性经济利益或个人关系可能影响本文所报告的工作。Steven D. Bruner|Jean Donadieu|Manon Delafoy|Ming Yang