《Clinical and Translational Discovery》：Advances in CRISPR-based detection technologies for severe fever with thrombocytopenia syndrome virus (Dabiebanda virus): A mini review
编辑推荐：
发热伴血小板减少综合征（SFTS）是一种由大别班达病毒（亦称SFTS病毒，SFTSV）引起的急性感染性疾病。该病主要通过蜱虫叮咬传播，在东亚地区呈散发流行，对人类健康构成严重威胁，报告病死率高达30%。2018年，世界卫生组织将SFTSV感染列为需要紧急研究和
发热伴血小板减少综合征（SFTS）是一种由大别班达病毒（亦称SFTS病毒，SFTSV）引起的急性感染性疾病。该病主要通过蜱虫叮咬传播，在东亚地区呈散发流行，对人类健康构成严重威胁，报告病死率高达30%。2018年，世界卫生组织将SFTSV感染列为需要紧急研究和治疗开发的优先疾病。近年来，该病毒的流行范围呈现逐步扩大趋势。因此，快速、灵敏且特异的SFTSV检测对于有效的疾病防控至关重要。CRISPR-Cas系统已成为一种有前景的分子诊断技术。通过采用特异性设计的引导RNA（如sgRNA或crRNA）指导Cas蛋白进行靶向核酸识别与切割，该方法相较于传统检测技术展现出更优越的灵敏度和特异性。该技术已越来越多地应用于SFTS的诊断。尽管其相较于传统方法具有显著优势，但在技术稳定性、成本效益以及与现有诊断平台的整合方面仍面临挑战。本小型综述重点介绍了基于CRISPR的SFTSV检测技术的最新进展，并探讨了其在实现快速诊断和支持精准疾病管理方面的潜力。
论文主体内容总结
2 基于CRISPR的SFTSV检测平台
为满足不同检测场景的需求，并在灵敏度、操作便捷性、污染控制和可及性等因素间取得平衡，研究人员近期开发了多种基于CRISPR的SFTSV检测平台。这些平台通过组合不同的Cas蛋白、核酸扩增技术及信号读取方式，实现了差异化的检测性能和应用定位。
2.1 荧光-CRISPR检测
荧光-CRISPR检测法是最常用的方法。其原理是在CRISPR系统中引入两端分别标记荧光基团和淬灭基团的单链DNA或RNA分子。当存在目标片段时，Cas蛋白切割单链核酸，释放荧光信号。Shu等人于2025年将重组酶聚合酶扩增（RPA）与CRISPR检测结合，建立了一种基于荧光报告分子的SFTSV一管式快速检测方法。该方法仅需恒温装置和荧光检测器，无需其他昂贵仪器，45分钟内即可完成，检测限（LoD）为11.7拷贝/反应。然而，荧光检测法需要专门的荧光检测设备，且荧光指示剂价格较高，增加了检测成本。因此，视觉检测策略被用于SFTS诊断。
2.2 可视化CRISPR-侧流层析检测
侧流层析试纸条（LFA）具有结果快速、操作简便、可单人份检测和成本低廉等优点。Park等人于2022年开发了一种结合CRISPR-Cas12a、逆转录RPA（RT-RPA）和LFA读出的SFTSV分子诊断方法。在该体系中，目标DNA序列与crRNA结合，激活Cas核酸酶对ssDNA报告分子进行反式切割。反应结束后，将体系加入LFA中。存在目标基因时，FAM标记的金纳米颗粒结合在T线并显色；反之，则C线显色而T线不显色。该方法的检测限为1 CFU/反应（假型慢病毒）或100拷贝/反应（体外转录RNA）。Huang等人也开发了类似方法，荧光法和LFA法的检测限分别为5拷贝/反应和50拷贝/反应。此外，利用Cas13a更高的反式切割活性，研究人员设计了多酶恒温快速扩增（MIRA）-CRISPR/Cas13a方法，荧光法和LFA法的检测限分别为10拷贝/反应和100拷贝/反应。另一项基于CRISPR/Cas13a-LFA的方法通过重组酶辅助扩增（RAA）预扩增，实现了5拷贝/反应的灵敏度。可视化CRISPR-LFA检测无需高级分析设备，但试纸条价格较高，不适合批量检测，且结果依赖主观观察。
2.3 可视化CRISPR-脱氧核酶检测
为克服LFA方法成本高、不适于大规模筛查的缺点，研究人员发展了基于脱氧核酶（DNAzyme）的可视化策略。例如，富含鸟嘌呤的序列可折叠形成G-四链体结构，与氯化血红素结合后形成的复合物能催化底物氧化显色。Wang等人将Cas12a与G-四链体DNAzyme整合，构建了名为RCCD的检测系统。存在目标序列时，Cas12a-crRNA复合物被激活并切割G-四链体结构，阻止后续显色反应；反之，则发生显色反应。该方法可检测低至1拷贝/反应，无需昂贵设备，适合现场检测，但仅为定性检测且操作步骤繁琐。
2.4 数字CRISPR检测
鉴于SFTS严重程度可能与病毒载量相关，有必要开发定量检测方法。数字PCR（dPCR）能实现核酸分子的绝对定量。数字CRISPR技术与之类似，通过将批量的CRISPR反应转化为数千个独立的微反应器来实现绝对定量。Zuo等人开发了基于CRISPR/Cas13a的数字检测方法，可在10分钟内提供定性结果，30分钟内完成定量测试。尽管数字CRISPR能够实现绝对定量，但由于设备成本高昂、体积庞大、样品前处理要求严格等限制，不适合现场快速检测。
2.5 CRISPR-生物传感器检测
单微环谐振器（SMR）生物传感器是一种通过测量目标生物分子结合到传感器表面引起的共振波长偏移来进行检测的高灵敏度光学器件。研究人员将CRISPR-Cas9与SMR生物传感器结合，创建了一种无标记、实时检测SFTSV的方法。通过在SMR传感器表面固定RPA扩增引物，病毒RNA经逆转录为cDNA后启动扩增。Cas9蛋白在sgRNA引导下结合SMR传感器上的目标序列，增加分子质量，提高检测灵敏度。该方法可在20分钟内完成检测，但存在温控和光路设备昂贵、样本基质干扰大等缺点。
2.6 基于CRISPR的多重检测
现有的SFTSV CRISPR检测方法通常为单管单基因检测。Zhu等人开发了能够在单个反应中识别不同目标的CRISPR多重检测系统。该系统利用Cas12a和Cas13a分别对ssDNA和ssRNA的非特异性切割偏好性来区分靶标。Cas13a检测SFTSV L基因，Cas12a检测M基因，结合荧光可视化和LFA，该系统对L基因和M基因的灵敏度分别为15拷贝/反应和40拷贝/反应。
2.7 免扩增CRISPR检测
CRISPR检测常需核酸预扩增，增加了复杂性和时间。Zeng等人开发了PASSPORT方法，这是一种无需预扩增的SFTSV快速现场检测方法。该方法利用LwaCas13a与工程化茎环RNA（URH）结合的自放大信号策略。在没有靶标RNA时，LwaCas13a-crRNA复合物保持失活；当与靶标RNA结合后，复合物被激活，非特异性切割单链RNA，进而破坏URH的发夹结构并释放出可作为次级靶标的序列，再次激活复合物，形成循环放大效应。该方法可在短短5分钟内完成SFTSV检测。
