β-Catenin缺失的椎间盘细胞减弱趋化转录及髓系细胞向小鼠损伤椎间盘的募集

《Aging Cell》：β-Catenin-Deficient Intervertebral Disc Cells Reduce Chemotactic Transcription and Myeloid Cell Recruitment to Injured Discs of Mice

　　

摘要 衰老通过过度炎症和免疫细胞的存在加剧了椎间盘源性慢性腰背痛（discogenic chronic low back pain, cLBP）的发病率。衰老会降低椎间盘（intervertebral disc, IVD）的Wnt信号，该信号与IVD细胞分化、IVD细胞增殖及抗炎信号相关。然而，体内Wnt信号缺失的IVD细胞（模拟衰老IVD细胞）如何调控趋化信号及免疫细胞募集尚不清楚。研究人员假设Wnt信号缺失的IVD细胞会减弱 na?ve IVD及IVD损伤响应中的趋化转录和免疫细胞募集。首先，由于衰老会降低所有IVD细胞中的Wnt信号，研究人员利用AcanCreERT2删除了β-catenin。β-catenin缺失使雄性和雌性IVD中的单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1, MCP1/CCL2）Ccl2分别降低了58%和79%（n = 5–6/性别）。利用髓系细胞的正电子发射断层扫描/计算机断层扫描（positron emission tomography/computed tomography, PET/CT）成像（5月龄小鼠，n = 4 IVD/性别/组），β-catenin缺失使na?ve IVD中的髓系来源细胞负荷降低了79%，并使IVD损伤诱导的募集减弱了48%。其次，由于髓核（nucleus pulposus, NP）细胞在生命早期便开始丧失Wnt信号，研究人员利用ShhCreERT2删除了β-catenin。与WT IVD损伤后的RNA测序（n = 3/组）相比，NP细胞中β-catenin的缺失损害了免疫细胞通路的激活，如MCP1/CCL2。综上，IVD Wnt信号转录共辅因子β-catenin的缺失损害了IVD损伤诱导的趋化转录组响应及髓系细胞积聚。这些数据表明，衰老IVD细胞中的低度IVD炎症和慢性IVD免疫细胞积聚受IVD Wnt信号调控。

论文解读：β-Catenin缺失的椎间盘细胞减弱趋化转录及髓系细胞向损伤椎间盘的募集

一、研究背景与科学问题

衰老是椎间盘退变（intervertebral disc degeneration, IVDD）和慢性腰背痛（chronic low back pain, cLBP）的主要驱动因素。衰老伴随的慢性炎症状态及免疫细胞浸润被认为是椎间盘源性疼痛加重的重要机制，但衰老如何通过椎间盘细胞内在变化影响免疫细胞募集，其分子机制尚不明确。Wnt信号通路是调控细胞分化、增殖及炎症反应的关键通路，衰老过程中椎间盘细胞Wnt信号显著下降，并与椎间盘细胞成熟、功能减弱相关。然而，体内Wnt信号缺失的椎间盘细胞如何影响趋化因子转录及免疫细胞募集，此前缺乏直接证据。因此，研究人员构建了模拟衰老椎间盘细胞Wnt信号缺失的基因修饰小鼠模型，旨在阐明椎间盘细胞内在Wnt信号在椎间盘损伤后炎症响应和髓系细胞募集中的作用，为理解年龄相关椎间盘源性疼痛的机制提供新视角。

二、研究设计与主要结论

研究人员利用两种他莫昔芬诱导的Cre-loxP基因敲除小鼠模型：AcanCreERT2介导的β-catenin全椎间盘敲除（cKO^ACN）和ShhCreERT2介导的β-catenin髓核特异性敲除（cKO^SHH），并结合尾椎压缩（tail compression, TC）损伤模型、PET/CT髓系细胞示踪成像、免疫组化及批量RNA测序，系统研究了Wnt信号缺失对椎间盘损伤后趋化转录和髓系细胞募集的影响。研究发现，β-catenin缺失显著降低了椎间盘单核细胞趋化蛋白-1（MCP1/CCL2）基因表达，减少了na?ve椎间盘髓系细胞负荷，并削弱了损伤诱导的髓系细胞募集。转录组分析显示，髓核特异性β-catenin缺失损害了损伤诱导的免疫相关通路激活，转而增强了细胞增殖与分化相关通路，并下调了serpinA1、ephx2等抗炎及趋化抑制因子。这些结果表明，椎间盘Wnt信号缺失模拟了衰老椎间盘的低炎症响应状态，可能通过改变趋化信号和免疫细胞募集影响椎间盘损伤修复及疼痛发展。

三、主要关键技术方法

研究人员使用了以下关键技术方法：1）基于AcanCreERT2和ShhCreERT2他莫昔芬诱导的β-catenin条件性基因敲除小鼠模型，分别实现全椎间盘和髓核特异性Wnt信号缺失；2）尾椎压缩（TC）机械损伤模型，控制IVDD的严重程度、时间和椎间盘节段；3）⁸⁹Zr标记的PERFECTA-HDL纳米颗粒结合PET/CT成像，活体追踪髓系细胞在椎间盘的分布和募集；4）批量RNA测序结合基因本体（Gene Ontology, GO）和Reactome通路分析，解析损伤及基因型差异的转录组变化；5）免疫组化检测cd11b髓系细胞浸润。样本来源于C57BL/6背景的基因修饰小鼠及不同月龄（5、12、24月龄）的野生型小鼠。

四、研究结果

1. 聚集蛋白聚糖谱系细胞中β-catenin缺失降低ccl2基因表达，且不调控脊索细胞或细胞外基质基因表达

利用TCF/Lef:H2B-GFP Wnt报告小鼠，β-catenin缺失使雄性椎间盘纤维环（annulus fibrosus, AF）细胞GFP阳性率降低62%，雌性降低43%（未达显著）。β-catenin基因表达在雄性和雌性椎间盘中分别降低65%和90%。Dkk1在雄性中升高167%，Lef1在雄性和雌性中分别升高294%和172%。Ccl2在雄性和雌性中分别降低58%和79%。雄性中il1b升高385%、s100a9升高200%，雌性中无显著变化。脊索细胞、NP细胞、AF细胞标志物及细胞外基质（extracellular matrix, ECM）相关基因均未受β-catenin缺失影响。

2. 椎间盘特异性β-catenin缺失减少na?ve椎间盘髓系细胞并损害损伤诱导的募集

PET/CT成像显示，雄性cKO^ACN小鼠na?ve椎间盘“Bone-IVD-Bone”区域信号降低76%，IVD区域降低79%。损伤后WT小鼠“Bone-IVD-Bone”和IVD区域信号分别增加1009%和838%，cKO^ACN分别增加2209%和2344%，但cKO^ACN的绝对信号强度较WT低约50%。雌性小鼠损伤响应较弱，β-catenin缺失对损伤诱导信号的抑制作用在雌性中减弱。cd11b免疫组化证实，损伤使WT和cKO^ACN雄性椎间盘外周cd11b染色增加65%–70%，雌性增加100%–400%，但β-catenin缺失使损伤诱导的cd11b上调在雄性和雌性中分别减弱30%和42%。

3. 髓核特异性β-catenin缺失上调发育生物学和免疫细胞相关通路，下调少数通路

与WT对照相比，cKO^SHH椎间盘显著上调的前20个通路中55%与发育生物学相关、25%与代谢相关、20%与免疫通路相关。下调通路主要涉及“细胞对外部刺激的响应”（15%）和“神经元系统”（40%），其中仅“对含嘌呤化合物的响应”、“对有机磷的响应”和“突触传递，谷氨酸能”达到显著水平。

4. 髓核细胞β-catenin缺失改变椎间盘损伤的转录组响应

主成分分析（principal component analysis, PCA）显示，WT和cKO^SHH小鼠的损伤椎间盘与各自对照椎间盘转录组明显分离。对照状态下WT与cKO^SHH转录组重叠，但损伤后WT与cKO^SHH转录组无重叠，表明β-catenin缺失导致损伤响应转录组发生显著改变。

5. 髓核特异性β-catenin缺失损害椎间盘损伤诱导的免疫通路上调

损伤在WT椎间盘中显著上调2967条通路，cKO^SHH中上调2381条，其中1992条共享。WT损伤椎间盘前20个上调通路中60%为免疫相关，而cKO^SHH中缺乏此类通路。WT损伤特异性上调“单核细胞趋化蛋白-1产生的正调控”通路（FE = 4.5），cKO^SHH中未显著激活。WT中损伤特异性上调saa3、bmp2、cxcl2等中性粒细胞趋化相关基因，cKO^SHH中则特异性上调“逆转录”通路（FE = 3.2）。

6. 髓核特异性β-catenin缺失促进损伤诱导的信号转导通路下调

损伤在WT中下调860条通路，cKO^SHH中下调895条，446条共享。ECM相关通路在两组中均占前20个下调通路的20%。WT损伤下调通路中40%与肌肉收缩相关，如“横纹肌细胞发育”（FE = 4.1）；cKO^SHH损伤下调通路中70%为信号转导相关，如“BMP信号调控”（FE = 3.9）。

7. 髓核特异性β-catenin缺失损害促炎转录并下调趋化抑制剂serpinA1a

损伤在WT和cKO^SHH中共享上调109个基因，WT特异性上调220个（如saa3、nos2、il1β），cKO^SHH特异性上调178个（如myog、twist2、pole）。共享下调168个基因，WT特异性下调140个，cKO^SHH特异性下调369个。直接比较损伤响应时，cKO^SHH相对WT下调最显著的前7个基因中5个与炎症相关，包括serpinA1a、serpinA1c、serpinA1d、ephx2和gpld1。

8. β-catenin缺失将损伤转录组响应从早期免疫细胞转向晚期免疫细胞

WT损伤椎间盘显著上调il1β（约40倍）、M1巨噬细胞标志物nos2（超50倍）、中性粒细胞趋化因子/受体对cxcl2/cxcr2（约100倍和5.6倍）及arg1（12倍）。cKO^SHH损伤椎间盘则上调M2巨噬细胞标志物mrc1（2倍）、嗜碱性粒细胞标志物cd123（4.3倍）、serpinA1a（10倍）及ephx2（4.2倍）。

9. 衰老损害损伤诱导的细胞因子表达并改变趋化基因表达

5、12、24月龄小鼠TC损伤后，il6在各年龄组雌雄椎间盘中均上调，但雌性衰老小鼠中il6的损伤诱导上调减弱。serpinA1a的损伤响应随年龄变化：青年小鼠无显著变化，中年小鼠上调，老年雌性小鼠下调而老年雄性小鼠上调。

五、讨论与结论

研究人员指出，椎间盘Wnt信号缺失模拟了衰老椎间盘细胞的低炎症响应状态。衰老椎间盘细胞通过减弱趋化转录和髓系细胞募集，可能削弱损伤后的适当免疫修复过程，同时伴随全身性“炎症衰老”（inflammaging）环境，形成年龄相关椎间盘源性疼痛的潜在机制。髓核特异性β-catenin缺失在损伤中显著下调ephx2和serpinA1旁系同源基因，二者均具有抗炎和调节免疫细胞募集的作用。Wnt信号缺失还促进了非椎间盘骨骼干细胞分化相关转录因子的上调，如zic1、myod1和myog，提示细胞分化程序改变。研究结论认为，衰老椎间盘细胞中Wnt信号缺失可能通过减弱促炎基因表达和免疫细胞募集，影响椎间盘损伤修复和慢性疼痛发展，提示针对年龄相关椎间盘源性cLBP的治疗策略需平衡全身炎症与椎间盘趋化信号在免疫细胞募集中的作用。