《Environmental Microbiology》：Identification of Molecular Pathways Underlying Mn(II) Oxidation in Pseudomonas resinovorans
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Pseudomonas resinovorans菌株MOB-513中的锰(II)氧化此前已被认为与生物膜形成相关联，该过程由第二信使bis-(3′–5′)-cyclic dimeric GMP (c-di-GMP)介导，然而介导这一调控的具体分子组分尚未被鉴定
Pseudomonas resinovorans菌株MOB-513中的锰(II)氧化此前已被认为与生物膜形成相关联，该过程由第二信使bis-(3′–5′)-cyclic dimeric GMP (c-di-GMP)介导，然而介导这一调控的具体分子组分尚未被鉴定。本研究探讨了MOB-513中参与Mn(II)氧化的遗传网络。通过转座子诱变，研究人员鉴定了多个在Mn(II)氧化能力方面存在差异的突变体。针对丧失氧化能力的突变体的靶向分析显示，转座子插入破坏了pilC、algR和hk05390基因，这些基因分别编码核心IV型菌毛(Type IV pilus, Tfp)组分、菌毛生物合成调节因子以及一种未表征的组氨酸激酶。结果表明，这些突变体的表型与生物膜形成受损、胞内c-di-GMP水平降低以及Tfp产量下降相关。研究人员鉴定了两个与MOB-513中Mn(II)氧化相关的c-di-GMP依赖性通路调节因子。在dgc05792基因启动子区域含有转座子插入的超氧化菌株中，多种Mn(II)氧化酶的表达上调。RR05389进一步调节胞内c-di-GMP水平和Mn(II)氧化，并作为组氨酸激酶HK05390的推定同源响应调节因子发挥作用。综上所述，这些结果拓展了研究人员对Mn(II)氧化分子通路的理解，并为优化生物法除锰策略确定了新的靶点。
1. 研究背景
锰(Mn)是地壳中含量丰富的金属元素，常以溶解态Mn(II)形式渗入地下水，影响饮用水水质并带来健康风险。生物砂滤技术因其高效、低成本和环境友好而被广泛用于地下水除锰，其核心在于依赖锰氧化细菌(MOB)将可溶性Mn(II)转化为不溶性Mn(III/IV)氧化物(MnOx)。MOB通常定殖于滤料表面并形成生物膜，该能力对于滤池成熟至关重要。然而，在实际应用中，地下水MOB丰度低常导致除锰效率低下。尽管已知细菌Mn(II)氧化主要由多铜氧化酶(MCO)和锰过氧化物酶(MOP)催化，但其表达的诱导因素及Mn(II)氧化对微生物的潜在益处仍不清楚。在模式菌株Pseudomonas putida GB-1中，已发现双组分系统(TCS)对Mn(II)氧化至关重要，但不同菌株间的调控机制可能存在差异。近期研究在环境分离株Pseudomonas resinovorans MOB-513中发现了一条由第二信使c-di-GMP调控的新型信号通路，将c-di-GMP信号、生物膜形成与Mn(II)氧化直接联系起来，但调控此过程的本地二鸟苷酸环化酶(DGC)和磷酸二酯酶(PDE)及额外通路的全貌仍有待探索。因此，本研究旨在系统鉴定MOB-513中参与Mn(II)氧化的遗传决定因子，以深入理解其调控网络并优化生物除锰策略。
2. 研究概述
为探究上述问题，研究人员对P. resinovorans MOB-513进行了随机转座子诱变筛选，鉴定并分析了丧失或增强Mn(II)氧化能力的突变体。研究发现，IV型菌毛(Tfp)、双组分系统(TCS)以及c-di-GMP代谢相关基因是调控Mn(II)氧化的关键因素。主要结论包括：1）Tfp的生物合成与完整性对Mn(II)氧化至关重要；2）鉴定出一个新的由组氨酸激酶HK05390和响应调节因子RR05389组成的TCS，该系统通过调控c-di-GMP水平正向调节Mn(II)氧化；3）本地二鸟苷酸环化酶Dgc05792的激活能特异性提升c-di-GMP水平，进而上调多种Mn(II)氧化酶（如Mop04787/Mop04788、Mco03244、Mco02544），导致超氧化表型；4）AlgR作为Tfp生物合成的正调控因子，也参与Mn(II)氧化调控。此项研究首次揭示了Tfp在Mn(II)氧化中的必要性，并阐明了一个区别于GB-1菌株MnxS1/S2/R系统的、独特的c-di-GMP依赖性TCS调控网络，为开发高效生物除锰技术提供了新靶点。
3. 主要关键技术方法
研究人员采用的主要关键技术方法包括：1）利用携带mariner转座子的质粒pALMAR3对MOB-513进行随机转座子诱变，在含Mn(II)的选择性培养基上筛选具有不同氧化表型的突变体；2）通过任意PCR和Sanger测序定位转座子插入位点；3）利用基于c-di-GMP响应性启动子PpelA驱动的msfGFP荧光报告系统，定量检测胞内c-di-GMP水平；4）采用标记-free蛋白质组学结合液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)，比较野生型与各突变体的全蛋白表达谱，以揭示生理变化；5）通过透射电子显微镜(TEM)观察细胞表面IV型菌毛和鞭毛的组装情况。
4. 研究结果
3.1 随机转座子诱变鉴定出导致MOB-513中Mn(II)氧化丧失或增强的关键因子
通过对约2000个克隆的随机转座子文库进行筛选，研究人员获得了80个非氧化型和18个超氧化型突变体。测序定位结果显示，非氧化型突变体中，48.75%的插入位点位于Tfp生物合成或组装相关的11个不同基因中，其中pilC基因（编码核心Tfp组分）被破坏次数最多（10次）。此外，还发现了涉及c-di-GMP代谢（12.5%）、生物膜形成（6.25%）、跨膜转运（13.75%）等功能的基因。超氧化型突变体中，55.56%的插入发生在dgc05792基因（编码GGDEF结构域蛋白）的启动子区域，暗示其表达上调导致了c-di-GMP水平升高。
3.2 MOB-513中锰调控双组分系统元件的功能见解
基因组预测分析鉴定出MOB-513中存在60个组氨酸激酶(HK)和80个响应调节因子(RR)。其中，hk05390与rr05389基因相邻且可能共转录，形成一个假定的TCS。AlgR被预测为含有LytTR DNA结合域的RR，可能与上游的组氨酸激酶AlgZ构成另一个TCS。BLASTP分析表明，MOB-513中鉴定的这些TCS与P. putida GB-1中必需的MnxS1-MnxS2-MnxR系统无显著相似性，表明其受控于不同的调控网络。
3.3 MOB-513转座子突变体中Mn(II)氧化的丧失与生物膜形成减少相关
选取pilC、algR、hk05390的非氧化型突变体和dgc05792启动子区域的超氧化型突变体进行深入研究。Mn(II)氧化定量测定证实，三个非氧化型突变体几乎不产生MnOx，而超氧化型突变体的Mn(II)氧化能力较野生型提高了1.96倍。生物膜定量实验显示，非氧化型突变体的生物膜形成量显著减少（1.78至2.18倍），而超氧化型突变体则增加了约1.63倍。互补实验恢复了algR和hk05390突变体的表型，表明Mn(II)氧化能力与生物膜形成能力高度相关。
3.4 MOB-513突变体中蹭行运动和鞭毛泳动受到差异性影响
蹭行运动（依赖Tfp）在pilC和algR突变体中完全丧失，在hk05390突变体中减弱1.90倍。相反，泳动运动（依赖鞭毛）在三个非氧化型突变体中均增强（1.67至1.72倍），而在超氧化型突变体中则显著减弱（2.82倍）。TEM观察结果与此一致：pilC和algR突变体无可检测的菌毛，hk05390突变体菌毛减少，而超氧化型突变体缺乏可检测的鞭毛。这证实了Tfp与鞭毛活性之间的负相关关系，以及它们与生物膜/Mn(II)氧化状态的关联。
3.5 MOB-513突变体中c-di-GMP水平的改变导致不同结果
利用荧光报告系统检测胞内c-di-GMP水平，发现三个非氧化型突变体的c-di-GMP水平显著低于野生型（1.51至1.68倍），而超氧化型突变体则显著升高（1.30倍）。通过过表达外源dgcB基因人为提高非氧化型突变体中的c-di-GMP水平，结果发现只有hk05390突变体的Mn(II)氧化和生物膜形成得到恢复，而pilC和algR突变体未能恢复。这表明HK05390可能作用于某个DGC的上游来调控c-di-GMP稳态，而完全失去菌毛则无法通过提高c-di-GMP来补偿。
3.6 Dgc05792和RR05389提升c-di-GMP水平并促进Mn(II)氧化和生物膜形成
在野生型菌株中过表达dgc05792或rr05389均能显著提升c-di-GMP水平，并增强生物膜形成（分别为1.68倍和2.43倍）和Mn(II)氧化能力（分别为1.80倍和2.62倍）。然而，在hk05390突变体背景下过表达rr05389却无法恢复生物膜形成和Mn(II)氧化表型，表明RR05389的功能依赖于HK05390，二者可能作为一个同源TCS对共同调节c-di-GMP水平。
3.7 非氧化型和超氧化型突变体相对于MOB-513野生型表现出特定的蛋白质组变化
比较蛋白质组学分析显示，各突变体与野生型的蛋白质组差异有限，表明转座子插入的影响相对特异。在超氧化型突变体中，Dgc05792、两种锰过氧化物酶(Mop04787/Mop04788)、两种多铜氧化酶(Mco03244和Mco02544)以及一种假定细胞色素c(CytC)的丰度显著增加，这解释了其超氧化表型。值得注意的是，三种非氧化型突变体均共同下调了一种聚磷酸盐激酶2(PPK2)，这可能限制了GTP的可用性，从而降低了c-di-GMP的合成。
5. 讨论与结论
本研究通过随机转座子诱变，系统鉴定了P. resinovorans MOB-513中调控Mn(II)氧化的遗传网络。研究结果强调了Tfp在此过程中的核心作用，其完整性对于建立细胞间接触、局部提升c-di-GMP水平以及形成有利于Mn(II)氧化的生物膜结构至关重要。同时，本研究揭示了一个不同于模式菌株GB-1的新调控轴：由HK05390-RR05389组成的TCS通过调控本地DGC（如Dgc05792）的活性来精细调节胞内c-di-GMP水平，进而控制下游Mn(II)氧化酶（MOPs和MCOs）的表达时机和丰度，最终影响Mn(II)氧化效率。此外，AlgR通过调控Tfp生物合成间接参与此过程。该研究不仅阐明了Mn(II)氧化与c-di-GMP信号、Tfp及TCS之间的复杂联系，还鉴定了多个可作为优化生物除锰策略的新靶点，例如通过调控Dgc05792或HK05390-RR05389系统来增强MOB的除锰性能。
