《Integrative Zoology》：Seasonal and Regional Dietary Heterogeneity Is Associated With Gut Microbiota Differentiation in Przewalski's Gazelle (Procapra przewalskii)
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专业摘要翻译
青藏高原野生有蹄类动物在冬季经历食物资源的季节性变化，然而将食性与肠道菌群及代谢特征相关联的综合证据仍然有限。研究人员结合粪便DNA宏条形码技术（DNA metabarcoding）、16S rRNA基因测序、宏基因组学（metagenomics
专业摘要翻译
青藏高原野生有蹄类动物在冬季经历食物资源的季节性变化，然而将食性与肠道菌群及代谢特征相关联的综合证据仍然有限。研究人员结合粪便DNA宏条形码技术（DNA metabarcoding）、16S rRNA基因测序、宏基因组学（metagenomics）及非靶向代谢组学（untargeted metabolomics），对来自三个地区的82份普氏原羚（Procapra przewalskii）粪便样本的食性、肠道菌群组成、功能通路及粪便代谢特征进行了综合分析。在各地区内部进行季节性比较，并在同一季节内进行区域性比较。冬季食性表现出区域特异性，其中N地区以禾本科（Poaceae）和莎草科（Cyperaceae）为主，S地区以禾本科和豆科（Fabaceae）为主，W地区以鸢尾科（Iridaceae）为主；而夏季食性则转向包括菊科（Asteraceae）、伞形科（Apiaceae）、十字花科（Brassicaceae）和蓼科（Polygonaceae）在内的阔叶杂草类植物科。肠道菌群组成及KEGG三级功能在不同季节间存在差异。冬季富集的代表性菌属包括颤螺菌科（Oscillospiraceae）内的UCG-007、Akkermansia、Mailhella及Papillibacter，而夏季富集的菌属则包括Candidatus Saccharimonas、[Eubacterium]_brachy_group及Colidextribacter。冬季代表性通路包括辅因子生物合成（Biosynthesis of cofactors）、核苷酸糖生物合成（Biosynthesis of nucleotide sugars）、多种核苷酸糖生物合成（Biosynthesis of various nucleotide sugars）以及乙醛酸和二羧酸代谢（Glyoxylate and dicarboxylate metabolism）；夏季代表性通路则包括磷酸转移酶系统（Phosphotransferase system, PTS）、核糖体（Ribosome）、氨酰tRNA生物合成（Aminoacyl-tRNA biosynthesis）及肽聚糖生物合成（Peptidoglycan biosynthesis）。两个季节内粪便代谢组谱在不同地区间均存在差异，且食性不相似性与代谢组、属水平微生物及KEGG三级功能的不相似性显著相关。相关性分析将LEfSe鉴定的植物科与优势属水平菌群及KEGG三级通路联系起来。综上，这些结果支持食性变化与肠道菌群组成、功能潜力及粪便代谢特征变化之间存在密切联系。
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一、研究背景与科学问题
青藏高原被誉为“世界第三极”，其极端的气候波动和高度季节性的资源供给对野生有蹄类动物构成严峻的生存挑战，尤其在食物匮乏的冬季。肠道菌群作为宿主的“延伸表型”，通过提供代谢灵活性和增强营养功能，在帮助高原野生动物维持适应性和能量平衡方面发挥关键作用。普氏原羚（Procapra przewalskii）是青藏高原特有的濒危物种，也是青海湖流域的旗舰物种，目前被限制在严重破碎化的栖息地中。栖息地破碎化导致种群间连通性降低，即便地理距离较短，不同种群间的肠道菌群组成和功能潜力也表现出显著差异。以往研究基于区域植被类型特征结合16S rRNA谱推测，不同区域间肠道菌群的分化可能与可利用饲草资源的差异有关，但这些研究未直接鉴定动物实际取食的植物类群，因此食性组成与肠道菌群组成和功能之间的关联证据仍然有限。基于此，开展本研究以填补这一证据缺口，系统揭示食性异质性如何与肠道菌群及代谢特征相关联。
二、研究设计与主要结论
研究人员以青海湖周边三个普氏原羚分布区（沙岛SD、青海湖农场NC、哇玉乡WY）为研究区域，于2024年7月采集34份夏季新鲜粪便样本，于2024年12月采集48份冬季样本，共82份样本。通过整合粪便DNA宏条形码、16S rRNA测序、宏基因组测序和非靶向代谢组学四种技术手段，系统分析了食性组成、肠道菌群结构、功能通路和粪便代谢特征在季节和区域间的变化规律，并评估了食性与菌群之间的关联强度。
研究得出以下核心结论：冬季食性表现出明显的区域特异性，N区以禾本科和莎草科为主，S区以禾本科和豆科为主，W区以鸢尾科为主；夏季食性则普遍转向菊科、伞形科、十字花科和蓼科等阔叶杂草类植物科。肠道菌群组成和KEGG三级功能在冬夏季节间差异显著，冬季富集UCG-007、Akkermansia、Mailhella和Papillibacter等菌属，夏季则富集Candidatus Saccharimonas、[Eubacterium]_brachy_group和Colidextribacter等菌属。冬季代表性功能通路涉及辅因子生物合成、核苷酸糖代谢和乙醛酸/二羧酸代谢，夏季则涉及磷酸转移酶系统、核糖体、氨酰tRNA生物合成和肽聚糖生物合成。粪便代谢组谱在同一季节内不同区域间存在显著差异，且食性不相似性与代谢组、微生物及功能不相似性显著相关。这些发现表明，普氏原羚肠道菌群的季节性和区域性分化与其食性异质性密切相关，为理解这一濒危有蹄类动物的环境适应机制提供了重要科学依据，也为制定针对性保护策略奠定了基础。
三、关键技术方法
本研究采用四种核心技术手段：粪便DNA宏条形码技术，扩增叶绿体trnL（UAA）内含子g–h引物片段，基于中国科学院西北高原生物研究所自建参考数据库进行植物分类注释，在科水平分析食性组成；16S rRNA基因V3–V4高变区扩增子测序，基于SILVA数据库进行菌群分类学注释，在属水平分析肠道菌群组成；鸟枪法宏基因组测序，经组装、基因预测后比对KEGG数据库进行功能注释，在KEGG三级通路水平分析功能潜力；基于液相色谱–质谱联用（LC–MS）的非靶向代谢组学分析，结合HMDB和METLIN数据库进行代谢物注释。样本来源于青海湖周边三个分布区（SD、NC、WY）的82份新鲜粪便，均经液氮现场速冻保存。
四、研究结果
3.1 食性组成及差异分析。 通过粪便叶绿体trnL内含子宏条形码分析，共鉴定出99个高质量ASV，对应1纲、16目、21科、28属和20种植物，科水平注释覆盖率达65.66%。食性组成在区域和季节间均差异显著。WY组冬季以鸢尾科（65.76%）和禾本科（8.39%）为主，夏季以报春花科（68.88%）和禾本科（7.16%）为主；SD组冬季禾本科（45.95%）和菊科（47.44%）占比较高，夏季菊科（59.22%）和景天科（26.61%）显著增加；NC组冬季以莎草科（52.46%）和禾本科（21.87%）为主，夏季菊科（60.81%）和蔷薇科（11.05%）比例升高。LEfSe分析显示，冬季富集禾本科、莎草科和鸢尾科等纤维性植物，夏季则富集菊科、伞形科、十字花科、蓼科等阔叶杂草类植物科。
3.2 肠道菌群组成、功能潜力及代谢差异。 基于属水平16S rRNA谱和宏基因组KEGG三级功能谱的比较分析一致显示，各地区内部冬夏季节间肠道菌群组成和功能潜力均存在显著差异。冬季样本显著富集UCG-007、Akkermansia、Mailhella和Papillibacter，夏季样本则富集Candidatus_Saccharimonas、norank_o__RF39、[Eubacterium]_brachy_group和Colidextribacter。功能层面，夏季富集磷酸转移酶系统、肽聚糖生物合成、核糖体和氨酰tRNA生物合成等通路，冬季富集辅因子生物合成、核苷酸糖生物合成和乙醛酸/二羧酸代谢等通路。非靶向代谢组学分析显示，夏季（R2=0.702，p=0.001）和冬季（R2=0.286，p=0.001）粪便代谢组谱在区域间均显著分离，差异代谢物主要属于脂类、有机酸、有机杂环化合物和苯丙素类等。Mantel检验显示，夏季（r=0.800）和冬季（r=0.350）食性不相似性与粪便代谢组不相似性均显著相关。
3.3 食性组成与肠道菌群组成和功能的协同变化。 Procrustes分析显示，在全部五组比较中，食性结构与肠道菌群组成及功能谱在排序空间均存在显著对应关系。Mantel检验证实，食性结构与16S rRNA群落组成在所有比较组中均显著相关（p=0.001），食性结构与KEGG三级功能谱也呈显著正相关，其中冬季三区域比较中食性-功能关联最强（r=0.468）。基于db-RDA分析，食性结构对属水平菌群组成的解释度（校正R2）为0.121–0.269，对KEGG三级功能谱的解释度为0.220–0.593，功能谱的解释度普遍高于菌群组成。
3.4 关键食性植物科与肠道菌群组成和功能的关联分析。 Spearman相关分析显示，冬季富集植物科与Christensenellaceae_R-7_group和Akkermansia呈正相关，夏季富集植物科主要与norank_o__Clostridia_UCG-014和norank_o__RF39正相关。W区冬季富集的鸢尾科与Lachnospiraceae_UCG-010、Christensenellaceae_R-7_group和Monoglobus正相关，夏季富集植物科则与Prevotellaceae_UCG-004正相关。功能层面，冬季富集植物科主要与辅因子生物合成通路正相关，夏季富集植物科则与碳水化合物代谢、中心碳代谢和生物合成通路正相关。五组比较中，显著相关比例在菌群水平为29.34%–49.52%，在KEGG功能水平为17.77%–55.23%，两者均在W区季节性比较中最高。
五、讨论与结论
讨论部分指出，普氏原羚冬季食性呈现区域特异性，夏季食性普遍转向阔叶杂草类植物科，反映了该物种在高度季节性和空间异质性高原景观中具有显著的食性可塑性。冬季肠道菌群富集UCG-007和Akkermansia，可能分别与结构多糖降解和黏液层底物利用相关，有助于在食物质量下降的寒冷季节维持能量平衡；夏季富集的Candidatus_Saccharimonas、Colidextribacter和RF39群则与可发酵底物增加和发酵代谢增强有关。冬季功能通路偏向辅因子生物合成和核苷酸糖代谢，反映营养受限条件下的能量维持策略；夏季功能通路偏向底物摄取和细菌生长相关过程，与夏季食物中可发酵碳水化合物丰富相一致。冬季三区域间食性-功能关联最强，表明资源受限条件下食性对菌群功能的约束作用更为突出。W区冬季富集的鸢尾科与果胶降解菌Monoglobus等正相关，提示不同区域菌群可能采取不同的底物利用策略。尽管各区域季节富集的植物科不同，但其与KEGG通路关联方向呈现一致性，表明微生物功能可能更多受不同植物共享的营养特性影响，而非特定植物类群。
研究结论表明，普氏原羚的食性组成在季节和区域间差异显著，反映了其破碎化高原栖息地中食物资源的强烈空间异质性和季节性波动。冬季食性呈现明显区域特异性，夏季食性普遍转向更多样化的阔叶草本植物科，但各区域仍保留各自优势食性成分。与食性差异一致，肠道菌群组成和KEGG三级功能谱在冬夏季节间也呈现明显分化，不同季节富集不同的优势菌群和功能通路。粪便代谢组谱在同一季节内也因区域而异，与区域性食性变化一致，提示局部食性组成可能反映在粪便代谢特征中。本研究从食性组成、肠道菌群组成、功能潜力和粪便代谢组谱四个方面提供了综合证据，表明季节性和区域性食性异质性与普氏原羚肠道菌群和代谢特征的变异密切相关，为理解这一濒危有蹄类动物局部食性差异与肠道菌群变异的关联提供了基础。
