套细胞淋巴瘤CD19-CAR T细胞治疗后复发相关的ROR1上调：一种可被ROR1双特异性抗体靶向的脆弱性

《Leukemia》：ROR1 upregulation after CD19-CAR T-cell relapse in mantle cell lymphoma identifies a targetable vulnerability for ROR1-directed bispecific modalities

　　

致编辑：BTK抑制剂和CD19嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法是复发/难治性（R/R）套细胞淋巴瘤（MCL）的重要治疗手段，并取得了令人瞩目的缓解率。然而，由于治疗耐药、免疫逃逸或疗效减退，大多数患者最终仍会复发。双特异性抗体正在开发用于复发性疾病，已有多个获批或处于临床晚期阶段的候选药物。受体酪氨酸激酶样孤儿受体1（ROR1）是一种癌胚抗原，在血液和实体肿瘤中高表达，并在复发时进一步上调。通过与Wnt5a结合，ROR1促进癌细胞存活、增殖、转移以及与癌症干细胞特性相关的转录程序的激活。富含ROR1的癌症干细胞样细胞对靶向治疗和过继细胞治疗表现出内在耐药性，从而维持微小残留病和导致复发。MCL中异常的ROR1表达通过与CD19形成复合物并以不依赖B细胞受体的方式促进细胞生长。这些发现凸显了ROR1作为MCL中一个有吸引力的治疗靶点。目前已开发出多种靶向ROR1的双特异性抗体，并正在针对R/R B细胞恶性肿瘤患者进行临床评估。为了解决MCL中的治疗耐药和复发问题，研究人员开发了靶向ROR1的双特异性T细胞衔接抗体，作为可能对当前靶向治疗或CAR T细胞治疗无反应的患者的新选择。

研究背景与科学问题

套细胞淋巴瘤（MCL）是一种侵袭性B细胞非霍奇金淋巴瘤，尽管BTK抑制剂和CD19嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法在复发/难治性（R/R）MCL中取得了显著疗效，但大多数患者最终因治疗耐药、免疫逃逸或疗效衰减而复发，后续治疗选择极为有限。目前临床上针对CAR T细胞治疗后复发的主要方案是CD20双特异性抗体，但其活性有限且持久性不足。因此，寻找新的治疗靶点和策略以克服现有疗法的局限性，成为该领域亟待解决的核心问题。

受体酪氨酸激酶样孤儿受体1（ROR1）作为一种癌胚抗原，在多种血液和实体肿瘤中异常高表达，且在复发时进一步上调。ROR1通过与配体Wnt5a结合，促进癌细胞存活、增殖、转移及干性相关转录程序。更重要的是，在MCL中，ROR1可与CD19形成复合物，以不依赖B细胞受体（BCR）-BTK信号通路的方式驱动肿瘤生长。基于此，研究人员提出假设：ROR1在CAR T细胞治疗后的复发过程中可能发生上调，并可作为双特异性抗体靶向治疗的理想靶点。

研究方法概述

研究人员利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据集分析了不同治疗反应队列（包括正常对照、BTK抑制剂敏感/耐药、BTKi-CAR T双重耐药患者）的ROR1表达动态变化，并通过流式细胞术检测了初治和CAR T复发患者原代MCL标本的细胞表面ROR1水平。研究人员构建了两种形式的ROR1双特异性抗体：一种为Fab-scFv-KiH格式的全人源IgG样ROR1/CD3双特异性抗体（ROR1-bsAb），另一种为串联连接scFv-Fc格式的ROR1双特异性T细胞衔接器（ROR1-bTCE）。体外实验中，研究人员以健康供者T细胞或CD19-CAR T细胞为效应细胞，以MCL细胞系（包括BTK抑制剂耐药株JeKo-1 BTK-KD、Maver-1及CD19低表达的Z-138-R）和CAR T治疗复发患者的原代MCL细胞为靶细胞，通过乳酸脱氢酶（LDH）释放法和荧光素酶报告法评估细胞毒性，并通过ELISA检测细胞因子（IFN-γ、TNF-α）释放和颗粒酶B水平。体内实验采用NSG小鼠建立的细胞系来源异种移植瘤（CDX）模型，评估ROR1-bsAb和ROR1-bTCE的抗肿瘤效果及生存获益。

研究结果

ROR1在MCL复发后显著上调

通过对多组MCL患者队列、组织微阵列（TMA）及细胞系的综合分析，研究人员发现ROR1表达随疾病进展逐步升高。在BTKi和CAR T双重耐药的MCL中，ROR1 mRNA表达累积性增加。在CAR T治疗队列中，CAR T耐药标本的ROR1表达显著高于敏感标本（p < 2.22e-16）。流式细胞术也证实，CAR T复发患者原代MCL细胞的ROR1表面表达显著高于初治患者（p < 0.001）。

ROR1-bsAb的设计与功能验证

研究人员开发的ROR1-bsAb（Fab-scFv-KiH格式）能特异性结合人ROR1和CD3ε，有效介导T细胞活化标志物（CD25、CD69、CD71）上调，并诱导靶细胞依赖性IFN-γ、TNF-α和颗粒酶B释放。在体外细胞毒性实验中，10 nM和50 nM的ROR1-bsAb即可将健康供者T细胞重定向为强效杀伤效应细胞，对ROR1^high且BTK抑制剂耐药的MCL细胞系（JeKo-1 BTK-KD、Maver-1）产生显著的肿瘤杀伤活性。

ROR1-bsAb克服CAR T治疗耐药

利用从CAR T治疗复发患者获取的原代MCL细胞，研究发现单独的CD19-CAR T细胞对这些靶细胞的杀伤活性有限。而加入ROR1-bsAb（20-50 nM）后，能够以剂量依赖方式诱导强烈的肿瘤杀伤效应，有效克服了CAR T细胞耐药。

ROR1-bTCE增强CD19-CAR T细胞抗肿瘤活性

针对CD19表达下调导致的抗原逃逸，研究人员设计的ROR1-bTCE（串联scFv-Fc格式）能与CD19-CAR T细胞协同作用。在CD19^low的Z-138-R细胞和CAR T复发患者原代MCL细胞共培养体系中，添加ROR1-bTCE显著增强了CD19-CAR T细胞的细胞毒活性和细胞因子分泌。此外，通过Transwell系统，由工程化T细胞分泌的无Fc段ROR1-CD3-bTCE也能有效重定向旁观者T细胞，恢复对CAR T耐药MCL细胞的杀伤力。

体内抗肿瘤疗效验证

在NSG小鼠CDX模型中，ROR1-bsAb治疗组（50和400 μg/kg）相比单独T细胞组，显著抑制了Maver-1肿瘤的生长，其中高剂量组获得了显著的生存优势。同样，ROR1-bTCE联合T细胞治疗也在两个独立实验中持续展现出强大的肿瘤控制效果，显著延长荷瘤小鼠生存期，部分治疗组在第60天达到100%存活率。所有治疗组均未观察到明显的体重下降或其他毒性体征。

总结与讨论

本研究首次揭示了CD19-CAR T细胞治疗后MCL复发与ROR1表达上调之间的密切关联，并证明了这一脆弱性可通过靶向ROR1的双特异性抗体模式加以利用。研究人员得出结论：ROR1-bsAb介导的CD19-CAR T细胞重定向能够对ROR1^high且CAR T耐药的原始MCL细胞产生强效、剂量依赖的细胞毒性，这为将ROR1靶向策略纳入此类患者的后续治疗方案提供了有力依据。其中，Fab-scFv-KiH格式的ROR1双特异性抗体具有良好的可开发性和治疗窗口，支持其临床转化以及与CAR T细胞联用以克服抗原逃逸和复发；而无Fc段的ROR1-bTCE主要用于功能和验证研究。本研究的局限性包括样本量较小、单中心设计以及证据的临床前性质，因此结果应视为假设生成性质，需在更大规模队列中验证。尽管如此，这些结果支持继续探索ROR1导向的双特异性方法，无论是单独使用还是与CAR T细胞治疗联合，作为规避抗原逃逸并改善CD19-CAR T细胞治疗后复发MCL患者预后的有前景策略。