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数百万遗传变异与人类疾病相关，但绝大多数变异位于非编码基因组且大多为非因果，鉴定其下游机制极具挑战。研究人员开发了基于单等位基因染色质结构分析的 Micro Capture-C variant-to-function 平台（MCCv）。该平台可识别纳米尺度染色
数百万遗传变异与人类疾病相关，但绝大多数变异位于非编码基因组且大多为非因果，鉴定其下游机制极具挑战。研究人员开发了基于单等位基因染色质结构分析的 Micro Capture-C variant-to-function 平台（MCCv）。该平台可识别纳米尺度染色质构象变化，并将顺式调控元件（cis-regulatory elements，CRE）内变异与其靶基因联系起来；还可对位点内其他杂合变异进行定相（phasing），将调控变异与等位基因失衡基因表达关联，并在基因组编辑后直接读取变异对染色质互作的影响。研究人员利用该方法在 CD4+ T 细胞中研究了 405 个与免疫介导炎症性疾病相关的 cis-调控元件，发现一种此前未被描述的获得性功能机制：风险等位基因产生新 CTCF 基序（neo-CTCF motif），阻断超级增强子（super-enhancer，SE）与 SESN3 启动子的接触，从而提升自身免疫风险。研究人员进一步表明 SESN3 通过感知色氨酸调控哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信号，并利用小鼠模型证实其在自身免疫中的作用。
研究背景方面，全基因组关联研究（genome-wide association studies，GWAS）已鉴定大量疾病相关变异，但超过 95% 人类序列为非编码区，超过 90% 常见病变异位于非编码 cis-调控元件（CRE）中。非编码变异常通过改变增强子、启动子及染色质三维结构调控基因表达；然而染色质构象捕获（3C）类方法多为限制酶依赖，只能从酶切位点产生数据，分辨率常低于 500 bp，难以直接以单等位基因方式解析大多数变异的功能。此外，疾病信号常处于连锁不平衡（linkage disequilibrium，LD），一个信号可伴随数十至数百个变异，真正因果变异不足 5%，因此从 GWAS 信号到因果基因和机制的解读严重滞后。该研究发表于《Nature Genetics》，核心目标是建立高分辨率、单等位基因水平的 variant-to-function 体系，把非编码 GWAS 信号转化为因果元件、靶基因和可验证通路。
主要关键技术方法方面，研究人员采用 MNase 为基础的 Micro Capture-C variant-to-function（MCCv）平台，以寡核苷酸探针靶向变异位点，同时获得小于 800 bp 的短程连接（定义纳米尺度染色质结构）和 1 kb 至 1 Mb 的长程连接（定义位点结构）。研究样本包括 Jurkat 细胞、健康供体外周血分选的原代 CD4+ T 细胞，以及来自 All of Us 和 UK Biobank 的表型关联数据；体内验证使用造血干细胞和祖细胞（hematopoietic stem and progenitor cells，HSPC）移植联合实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）小鼠模型。方法上还结合定相 RNA-seq、ATAC-seq、CTCF ChIP-seq、Micro-C、碱基编辑（base editing）及内源标签共免疫沉淀（co-immunoprecipitation，co-IP）。
研究结果部分，单等位基因染色质结构直接鉴定功能变异中，研究人员利用短程接触矩阵在碱基对分辨率下刻画核小体定位和转录因子基序间接触，发现失活参考等位基因呈核小体条带，活化突变等位基因在核小体缺失区出现特异纳米结构；以 rs2793109 为例，替代风险等位基因形成 RUNX1 基序并改变与 ZNF438、ZEB1 启动子的长程互作，定相内含子单核苷酸多态（single-nucleotide polymorphism，SNP）后 TT-seq 显示 ZEB1 等位基因表达偏高。人类 CD4+ T 细胞疾病相关基因鉴定中，scATAC-seq 富集显示 CD4+ 中央记忆 T 细胞承载最高免疫介导炎症性疾病（immune-mediated inflammatory diseases，IMIDs）变异负担；MCCv 对 405 个增强子变异捕获显示，最强变异-启动子接触平均有约 839 个连接junction，而全基因组 Micro-C 仅约 2.5 个，LotronMCC 算法提名 251 个唯一因果基因，基因本体分析富集于免疫通路且优先基因为可成药靶点。单等位基因分析鉴定疾病相关调控元件中功能变异中，241 个杂合位点的 MCCv 显示 54.6% 疾病相关 SNP 至少一条接触显著改变，rs10950648 参考等位基因更强接触 AHR 启动子及邻近增强子，替代等位基因丢失 PRDM1 基序相关纳米接触；定相 RNA-seq 显示具有 MCCv 接触改变的初选/次选基因等位基因表达失衡显著富集。MCCv 鉴定多特质自身免疫位点 CTCF 介导获得性功能机制中，rs4409785 在 11q21 与多发性硬化（multiple sclerosis，MS）、类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）等相关，替代 C 等位基因创建保守灵长类中所缺的 neo-CTCF 基序，MCCv 和 CTCF ChIP-seq 均显示风险等位基因 CTCF 结合与开放染色质增强。结合 MCCv 与基因组编辑证明机制中，研究人员在 rs4409785 杂合原代 CD4+ T 细胞用胞嘧啶碱基编辑器 BE4max 编辑 CTCF 基序但不改 SNP 本身，单实验解卷积出六类编辑结果；编辑风险等位基因 CTCF 基序后，其与下游收敛 CTCF 位点的强接触及活化纳米结构回退至参考等位基因状态。新 CTCF 基序阻断超级增强子-启动子接触中，SESN3 与 FAM76B 均可接触 T 细胞特异超级增强子；风险 neo-CTCF 将超级增强子隔离成子结构，使 SESN3 启动子接触下降，RNA-seq 显示风险等位基因 SESN3 转录降低 36.6%。SESN3 体内验证及其通过色氨酸感知调控 mTOR 通路角色中，Sesn3 敲除 HSPC 移植后 EAE 发病更快、中枢神经浸润活化 T 细胞增多；人原代 CD4+ T 细胞饥饿条件下 Sesn3 敲除导致 mTOR 复合体 1（mTORC1）信号增强，内源标签 co-IP 显示 SESN3 与 GATOR2 在饥饿时相互作用增强，且色氨酸而非其他游离氨基酸可削弱该互作，表明 SESN3 是低色氨酸状态下抑制 mTORC1 的感知因子。
讨论部分总结中，研究人员指出限制酶 3C 只能覆盖约 30% 变异，而 MNase 基 MCCv 可在任意位点以碱基对分辨率做单等位基因纳米制图并同时捕捉长程 enhancer-promoter 接触，还可与碱基编辑直接偶联读取突变效应。该平台把 405 个 IMID 相关 CRE 缩小到 251 个提名因果基因，并显示有接触频率改变的非编码变异约三倍更可能对应转录等位基因失衡。rs4409785 是 GWAS 变异以 CTCF 获得性功能方式运作的清晰范例：不直接接触启动子，而是通过新边界 CTCF 重排子域、阻断超级增强子对 SESN3 的调控。研究人员还确立 SESN3 为免疫细胞中高表达、此前被低估的 mTOR 调控因子，并证明其通过色氨酸感知与 GATOR2 互作参与自身免疫。
研究结论翻译部分：在本研究中，研究人员描述了一种高分辨率方法，利用单个 cis-调控元件内的体内纳米尺度 DNA 结构来刻画非编码变异引起的染色质构象改变；MCCv 同时在同细胞群体中按等位基因精确绘制增强子-启动子接触，并可对位点内变异定相以整合 RNA-seq 等数据，也可与原代人细胞精确基因组编辑结合，稳健展示突变如何影响染色质结构。虽然已有等位基因特异性 3C 和 3C 接触的数量性状定位研究，但它们依赖限制酶，只能从酶切位点产生数据，仅约 30% 变异可被研究；MCCv 的 MNase 策略突破该限制，并产生更高接触频率分辨率。MCCv 一次可并行分析多达 12 个重复并进行捕获富集，本研究捕获 405 个位点，未来可扩展至 1000 个以上靶标。研究人员用 IMID 相关 GWAS 信号验证平台，提名 251 个因果基因；增强子-启动子接触存在并不总改变转录，但缺乏接触可强有力排除直接调控，因此 MCCv 大幅缩减疾病非编码变异可能影响的目标基因集合。该工作最突出地揭示一个通过 CTCF 基序获得性功能增加多种自身免疫病风险的变异，并用单实验六组编辑结果证明其改变染色质结构；该变异不接触启动子，而是降低 SESN3 与 T 细胞特异超级增强子接触，从而降低 SESN3 转录。研究还将 SESN3 确立为 mTOR 通路中感知色氨酸、与 GATOR2 互作并抑制 mTORC1 的自身免疫相关因子。鉴于遗传证据可使药物开发临床转化概率约提升 2.6 倍，MCCv 这类可规模化识别因果变异与基因的多面平台，对把非编码人类遗传学转化为可成药靶点和通路具有直接价值。
