《Nature Medicine》：Urine cell-free RNA for bladder cancer detection and treatment response prediction
编辑推荐：
尿液生物标志物有望改善泌尿生殖系统恶性肿瘤的非侵入性检测与分子表征。研究人员描述了尿液随机引物与亲和捕获游离细胞RNA片段富集测序（uRARE-seq）这一液体活检方法用于尿液cfRNA谱分析，并将其应用于683份癌症患者与对照者尿液样本。尿液cfRNA含有泌
尿液生物标志物有望改善泌尿生殖系统恶性肿瘤的非侵入性检测与分子表征。研究人员描述了尿液随机引物与亲和捕获游离细胞RNA片段富集测序（uRARE-seq）这一液体活检方法用于尿液cfRNA谱分析，并将其应用于683份癌症患者与对照者尿液样本。尿液cfRNA含有泌尿生殖组织转录本；在前列腺、肾脏或膀胱癌症患者中可见肿瘤来源转录本。uRARE-seq检测局限性膀胱癌时，在90%特异性下达到95%敏感性，优于尿液肿瘤DNA分析，且不受场效应突变影响。尿液cfRNA分析还可敏感检测微小残留病（MRD），并区分术后与卡介苗（BCG）灌注后的完全分子缓解。114例术前尿液中，完全应答者富集T细胞及其他免疫特征，提示既有抗肿瘤免疫反应；无应答者增殖相关基因表达更高。基于上述生物学差异，研究人员在114例术前尿液中构建了预测BCG相对于化疗应答可能性的生物标志物（曲线下面积0.93），该标志物与复发风险强相关。因此，尿液cfRNA分析是膀胱癌及其他泌尿系统恶性肿瘤有前景的生物标志物策略，但其临床效用仍需前瞻性研究验证。
研究背景方面，膀胱癌（bladder cancer, BLCA）患病率上升且随访监测资源消耗大，开发非侵入性检测与分子分型生物标志物十分重要。尿液直接接触BLCA，是非侵入性液体活检理想载体；尿液游离细胞RNA（cell-free RNA, cfRNA）虽有前景，但既往研究多聚焦少数基因，未充分挖掘全转录组信息。现有尿液细胞学对低级别肿瘤敏感性低，尿液肿瘤DNA（utDNA）受场效应突变影响特异性，且难以表征肿瘤生物学状态与免疫治疗反应。因此，研究人员开展尿液cfRNA高通量测序方法开发与验证，目标是实现BLCA无创检测、分级分期、微小残留病（minimal residual disease, MRD）监测和腔内治疗反应预测。
主要关键技术方法方面，研究人员改编血浆RARE-Seq为uRARE-seq，采用硅胶柱提取尿上清cfRNA，以全编码转录组与尿液稀有丰度基因（urine rare abundance genes, uRAGs）定制捕获面板进行靶向测序；样本来自683份尿液样本，包括健康对照、血尿或下尿路症状非癌对照、局限性BLCA、肾细胞癌（RCC）与前列腺腺癌（PRAD）患者，以及手术联合BCG或腔内化疗队列；借助CIBERSORTx反卷积、Hallmark基因集富集分析（GSEA）、弹性网络机器学习建模、T细胞受体（TCR）库分析和留一交叉验证完成分类与预测。
研究结果部分，Analysis of urine cfRNA显示，尿上清cfRNA高度片段化且富集上皮来源RNA，健康人尿液cfRNA主要来自膀胱、肾脏和前列腺组织，女性无前列腺基因表达，血浆cfRNA则缺乏泌尿生殖转录本，证明尿液cfRNA可无创表征泌尿生殖组织转录组。Urine cfRNA contains transcripts from GU tumors显示，BLCA、RCC与PRAD患者尿液cfRNA转录组可区分，各癌种已知标志基因一致差异表达，GSEA显示RCC缺氧、PRAD雄激素反应等特征，说明尿液cfRNA携带GU肿瘤来源转录本。Identifying urine rare abundance genes for targeted capture显示，研究人员从38例非癌对照定义3834个uRAGs并补入管家基因、突变或异常表达基因、免疫解卷积基因，形成4782基因面板；uRAG面板较全转录组捕获深度更高、检测基因更多。Urine cfRNA gene expression in patients with BLCA and noncancer controls显示，配对肿瘤组织与术前尿液cfRNA表达高度相关，差异分析识别出3383个基因，包括IGF2、CRH、ANXA10等BLCA高表达基因。Urine cfRNA-based detection of BLCA显示，弹性网络模型在训练队列AUC 0.97，90%特异性下敏感性95%，低级别Ta为86%、高级别Ta与T1及T2均为100%；验证队列表现接近；uRARE-seq检出率高于尿细胞学、肿瘤未知utDNA，且与肿瘤知情utDNA相当；场效应突变存在时性能不受影响。Grade and muscle invasion can be distinguished using urine cfRNA显示，级别模型训练与验证AUC均为0.84，侵袭模型交叉验证AUC 0.82、验证0.75；非肌层浸润（NMIBC）富集腔面标志，肌层浸润（MIBC）富集基底标志，级别分数还可提示病理低级但复发风险更高者。Detection of minimal residual disease using urine cfRNA显示，术后、BCG前、BCG后采样中，无复发者BCG后BLCA cfRNA全阴性，高级别复发者BCG后92%仍阳性；cfRNA阳性者高级别无复发生存更差，MRD检测优于utDNA。Identification of responders to surgery or BCG显示，分子完全缓解（mCR）术后或BCG后患者复发风险低；手术残留者富集EMT、糖酵解、血管生成，BCG残留者富集增殖通路，BCG完全缓解者富集TNF、IFN、炎症、补体、抗原呈递与T细胞特征。Transcriptomic features of BCG responders显示，BCG应答者富集肿瘤反应性CD4/CD8 T细胞、组织驻留记忆T细胞、三级淋巴结构、MHC I与抗原加工呈递特征，TCR克隆数更多、多样性更高，说明既有抗肿瘤免疫是BCG起效基础。Predicting responses to adjuvant BCG and chemotherapy显示，仅用免疫与增殖通路基因的模型在BCG训练队列AUC 0.93，高分对应mCR after BCG且与复发相关；锁定模型在57例BCG验证队列可预测复发，在38例腔内化疗队列中高分数反而预示化疗后复发，提示该分数可区分BCG获益者与化疗获益者。
讨论部分总结，研究人员指出uRARE-seq是无须配对肿瘤组织的单样本分类方法，检测敏感性优于细胞学与肿瘤未知utDNA，且不受场效应突变干扰；cfRNA可同时实现检测、分级分期、MRD和评估肿瘤生物学。BCG反应预测难点在于难以区分手术治愈与BCG治愈，uRARE-seq通过分子缓解分层解决了这一问题，并发现BCG完全缓解依赖既有免疫特征，而增殖型肿瘤可能更适合化疗。局限性包括病例对照设计、机构来源集中、部分亚组样本量小、非恶性泌尿疾病对照数有限、治疗队列非随机。结论为：uRARE-seq可实现BLCA敏感检测与分子表征，有望用于筛查、MRD检测和辅助治疗反应预测，也可拓展至其他泌尿良恶性疾病生物标志物开发，但临床效用仍需大型前瞻性研究确认。
研究结论部分翻译如下：在本研究中，研究人员介绍了uRARE-seq，一种用于尿液cfRNA敏感分析的无肿瘤先验方法，可非侵入性检测正常泌尿生殖组织与恶性肿瘤来源转录本。在BLCA患者中，uRARE-seq实现了高敏感性癌症检测，区分级别与肌层浸润等临床相关特征，并预测辅助腔内BCG免疫治疗相对于化疗的获益可能性。uRARE-seq的关键特征是无需配对肿瘤组织或其他尿液样本即可进行单样本分类；BLCA检测模型在90%特异性下达到95%术前敏感性，并在独立验证队列中复现。该方法对术前检测的敏感性高于细胞学与肿瘤未知utDNA，与靶向肿瘤知情utDNA性能相当。尿液cfRNA的BLCA检测特异性似乎不受场效应突变影响，因为携带场效应突变的尿路上皮细胞表达程序更接近正常而非BLCA细胞；检测模型还能高敏感性、高特异性识别术后与辅助治疗后的分子残留证据，支持其在MRD评估中的作用。cfRNA相较utDNA的关键优势是可分析数千基因表达以表征肿瘤生物学，区分低级别与高级别NMIBC、NMIBC与MIBC，并在病理低级肿瘤中识别更高复发风险特征。BCG反应生物标志物开发难点在于无法区分手术治愈与BCG治愈；尿液cfRNA可识别手术或BCG后的完全分子缓解者，BCG完全缓解者富集T细胞与免疫特征、低增殖程序，说明BCG起效需要既有免疫反应。BCG后分子残留病者高表达增殖基因，更易从腔内化疗获益；整合免疫与增殖基因的模型可预测两种治疗反应。目前BCG为一线首选但供应受限，能选择一线化疗获益者的预测标志物具现实意义。研究局限包括病例对照设计、两家邻近机构入组、部分分析样本量不大、非恶性泌尿疾病对照有限、治疗队列非随机。总之，uRARE-seq可实现BLCA敏感检测与分子表征，有望用于筛查、MRD检测和辅助治疗反应预测，并可能推动其他泌尿疾病精准医学生物标志物发展，但临床效用仍需前瞻性研究确立。
