外周人源单克隆抗体疗法调控神经炎症并促进狂犬病病毒属感染后的长期功能恢复

《Emerging Microbes & Infections》：Peripheral human mAb therapy yields modulation of neuroinflammation and long-term functional recovery from lyssavirus infection

狂犬病是一种由狂犬病病毒属（lyssavirus）病毒引起的致命性脑炎。研究人员此前已证明，腹腔内单次给予中和性人源单克隆抗体（monoclonal antibody, mAb）F11，可在中枢神经系统（central nervous system, CNS）入侵后保护小鼠免于致死性狂犬病病毒属感染。然而，F11中和作用的分子基础仍不清楚。在本研究中，研究人员采用结构和功能分析来界定F11及相关抗体A6的中和活性。冷冻电镜（cryo-electron microscopy, cryo-EM）和负染电镜（negative-stain EM）显示，两种抗体均结合糖蛋白G的结构域III（Domain III），识别一个与先前表征的抗体（包括RVC20）不同的融合前特异性表位。抗体结合可稳定融合前状态，从而阻断膜融合。研究人员进一步发现，单次给予A6或RVC20可保护动物免于澳大利亚蝙蝠狂犬病病毒（Australian bat lyssavirus, ABLV）诱导的死亡，同时促进显著的长期功能恢复。此外，A6同样可保护动物免于当前流行狂犬病病毒（rabies virus, RABV）野生分离株感染后的死亡。脑RNA转录组学分析及脑组织匀浆的蛋白质水平分析表明，A6治疗在感染急性期广泛降低了神经炎症介质的表达。值得注意的是，用非致死性减毒ABLV突变体感染动物可产生类似的神经炎症反应。因此，针对ABLV的强烈神经炎症反应并不能预测死亡。总体而言，外周给予A6及类似中和性mAb可通过抑制G蛋白融合前至融合后转变和调控神经炎症，促进CNS驻留性狂犬病病毒属感染后的存活和长期功能恢复。

论文解读

一、研究背景与科学问题

病毒性脑炎是由多种嗜神经病毒引起的严重且往往危及生命的脑部感染。一旦脑炎病毒进入中枢神经系统（central nervous system, CNS），治疗选择极为有限，对绝大多数此类感染而言，支持性护理是唯一选项。狂犬病病毒属（lyssavirus）是嗜神经病毒中最致命的一个属，病毒从外周组织暴露部位运输至大脑，引发狂犬病脑炎，致死率近乎百分之百。尽管已有有效疫苗和暴露后预防（post-exposure prophylaxis, PEP）手段，狂犬病每年仍导致约6万人死亡，对缺乏及时临床护理的国家造成不成比例的负担。关键在于，一旦狂犬病病毒属进入人类CNS并引发症状性狂犬病，目前尚无已知疗法能够阻止死亡。

目前已知18种狂犬病病毒属物种，在遗传学和抗原性上分为两个系统发育群（phylogroup），其中三种分歧物种未分组。狂犬病病毒（rabies virus, RABV）和澳大利亚蝙蝠狂犬病病毒（Australian bat lyssavirus, ABLV）是系统发育群I中亲缘关系密切的成员。RABV经犬咬伤传播，是全球人类狂犬病病例的主要病因；ABLV则是蝙蝠传播病毒，在澳大利亚已知人类病例中致死率为100%。

研究人员此前描述了两种人源单克隆抗体（monoclonal antibody, mAb）F11和A6，可在体外高效中和系统发育群I狂犬病病毒属（包括RABV和ABLV）。利用荧光素酶（luciferase, Luc）报告系统纵向追踪ABLV-Luc转录活性，研究人员此前证明，即使在CNS中已出现强劲ABLV转录活性后给药，单次外周给予F11也能有效保护动物免于发病和死亡。F11治疗与脊髓和脑中病毒载量显著降低相关，且诱导大量免疫细胞浸润脑组织并改变免疫细胞亚群组成，提示外周mAb治疗影响CNS免疫动态。重要的是，F11治疗在缺乏适应性免疫应答的小鼠中无效，CD4 T细胞和功能完整的mAb Fc区均为免于死亡所必需。这些结果挑战了长期以来认为抗体一旦CNS穿透后即无效的观点。

基于上述背景，本研究旨在：通过结构分析阐明F11和A6与ABLV表面糖蛋白（glycoprotein, G）相互作用的分子机制；评估A6和RVC20的体内疗效，确定F11的治疗特性是否可推广至其他中和抗体；测试A6对当前流行野生RABV株Ken-1感染的挽救效果；通过转录组学分析定义A6对感染相关基因表达变化的影响；利用减毒ABLV株分析基因表达变化是否与免于死亡存在机制性关联。

二、主要关键技术方法

本研究采用多种关键技术手段。结构生物学方面，设计了基于同源建模的ABLV-G结构域III可溶构建体（Pleckstrin homology domain, PHD），采用生物层干涉法（biolayer interferometry, BLI）测定结合亲和力，运用负染电镜（negative-stain EM）和冷冻电镜（cryo-electron microscopy, cryo-EM）解析抗体-PHD复合物高分辨率结构。体内研究方面，使用8周龄雌性白化C57BL/6（B6-albino）或C57BL/6小鼠（购自Jackson Laboratories），通过足垫注射感染ABLV-Luc（2×10⁵ FFU）或RABV-Ken-1（2×10³–2×10⁵ FFU），于感染后第5、7或9天单次腹腔给予mAb（10 mg/kg）。采用活体生物发光成像（bioluminescence imaging, BLI）纵向追踪病毒转录活性，网格倒置实验评估运动功能。转录组学方面，提取脑组织总RNA进行RNA测序（RNA-Seq），使用nf-core/rnaseq流程处理数据，DESeq2进行差异表达分析，基因集富集分析（gene set enrichment analysis, GSEA）鉴定通路。蛋白水平分析采用LEGENDplex多因子检测试剂盒定量脑匀浆和血清中13种可溶性介质。此外还进行了定量实时PCR（qRT-PCR）和脑组织病理学分析。

三、研究结果

ABLV-G PHD构建体的设计与验证

研究人员设计了可溶性ABLV-G PHD构建体，采用环形置换策略通过柔性2×G4S连接子连接两个不连续区域。BLI测定显示与A6和F11 Fab具有高亲和力相互作用（Kd分别为15和4.4 nM）。PHD-A6-RVC20冷冻电镜结构与融合前G三聚体（PDB: 7U9G）比对显示紧密的结构对应关系，所有Cα原子RMSD为0.786 ?，证实工程化PHD采用与天然糖蛋白相容的构象。

PHD-抗体复合物的负染电镜单颗粒分析

负染电镜显示，ABLV PHD与A6和RVC20 Fab混合后形成细长的蠕虫样颗粒，对应两个Fab同时结合PHD。而PHD-A6-F11混合物未形成此类结构，仅见分离的Fab样密度或Fab结合小球形密度，表明A6和F11识别重叠表位，而A6和RVC20结合不同且不重叠的位点。

PHD-A6-RVC20三元复合物的冷冻电镜结构

利用A6和RVC20同时结合形成的约110 kDa较大复合物，成功解析了高分辨率冷冻电镜结构。结构证实A6和RVC20结合不同且不重叠的表位，可同时结合而无空间位阻。RVC20界面与既往数据一致，A6则结合PHD相对面，主要涉及N端区域及相邻β链（j和k）。

A6识别的结构基础及PHD抗原表位的保守性

A6与ABLV PHD的界面由氢键、盐桥和疏水相互作用网络定义，主要由抗体重链介导。关键静电相互作用包括R100C与PHD E31之间、D31与PHD K198之间的盐桥，以及多个氢键和疏水接触。轻链贡献极小，仅Y49与PHD K202侧链和G34主链形成氢键。序列比对显示，参与A6识别的ABLV PHD关键残基在系统发育群I狂犬病病毒属中完全保守，仅Khujand病毒（KHUV）例外，但E33D保守替换可能保留相似的相互作用能力。系统发育群II和未分组病毒中这些位置的序列变异可能破坏关键接触，为A6和F11中和效力的有限广度提供了结构解释。

A6和RVC20对RABV G融合前构象的特异性

将PHD-A6-RVC20结构分别与RABV G融合前和融合后构象比对。在融合前三聚体中，PHD表位完全暴露，A6和RVC20均可容纳而无空间位阻。相反，与融合后构象比对显示结合抗体与糖蛋白中央结构域（central domain, CD）之间存在显著空间位阻，阻止抗体结合。这确立了A6和RVC20仅限于融合前状态，提示中和机制为抗体结合将RABV G锁定在亚稳态融合前状态，阻断膜融合所需的结构重排。

单次剂量A6或RVC20治疗在CNS入侵期间或紧随其后预防死亡

B6-albino小鼠感染2×10⁵ FFU ABLV-Luc后，于感染后第5、7或9天单次给予A6（10 mg/kg）。BLI显示第5和7天治疗的小鼠脊髓和脑中病毒转录水平普遍降低。所有治疗组小鼠在第9天开始出现临床症状，但多数存活小鼠的临床症状和体重减轻完全消退，握力恢复至接近基线水平。第5天治疗组100%存活，第7天33%，第9天16%，而所有未治疗动物在第15天前达到安乐死标准。RVC20同样作为单次剂量疗法有效，最大存活效果出现在第7天（100%存活），第5天50%，第9天67%。值得注意的是，RVC20治疗存活动物中功能恢复不完全的比例更高（8/13=62%未恢复至疾病评分0，7/13=54%未恢复至倒挂30秒以上），而A6治疗组仅1/9=11%未恢复。

单次剂量A6对当前流行犬源RABV株的高效性

体外中和实验显示，A6、F11和RVC20对Ken-1株均高效，F11和A6效力约为RVC20的3倍（IC₅₀分别为0.0022、0.0024和0.0068 μg/mL）。体内实验中，小鼠感染2×10⁴ FFU Ken-1后第5天给予A6或对照mAb m102.4（各10 mg/kg）。A6治疗组动物几乎无体重减轻，疾病评分≤2，100%存活；m102.4组仅18%存活。

单次剂量A6将炎症和抗病毒基因及蛋白表达降至与未感染对照相似水平

转录组学分析显示，m102.4治疗的ABLV感染动物与未感染对照相比，差异表达基因主要由炎症和抗病毒（如干扰素诱导）反应介导，多数基因表达上调。A6治疗的感染动物与未感染对照相比差异表达基因极少，表明A6治疗快速逆转或完全抵消了感染动物的炎症和抗病毒基因表达变化。GSEA鉴定出m102.4治疗组显著富集炎症和抗病毒通路。蛋白水平分析显示，IFN-γ、CCL2、IL-10、CCL5和CXCL10在m102.4治疗组脑中显著高于A6治疗组；CXCL1、GM-CSF、IFN-α、IFN-β、IL-6、IL-12p70和TNF-α在m102.4治疗组显著高于未感染和A6治疗组，A6治疗组与未感染组无显著差异。qRT-PCR证实A6治疗组脑内ABLV-Luc N转录本和反义基因组均显著降低。病理学分析显示，m102.4治疗组3/3动物脑内出现血管周围炎性浸润，A6治疗组仅1/3出现。

减毒ABLV变异株感染导致脑感染减少和炎症及抗病毒基因诱导降低

研究人员鉴定了一个自发产生的ABLV减毒变异株，其G基因存在单一K245E点突变。该突变株感染小鼠后，脊髓和脑中病毒转录强度、疾病表现和体重减轻程度均低于野生型，所有G(K245E)感染动物存活，而野生型组0/6和1/6存活。转录组学分析显示，G(K245E)感染诱导的炎症和抗病毒转录谱与野生型高度相似，但野生型组的炎症和抗病毒转录信号更强。GSEA显示两种病毒均强烈富集免疫和炎症通路，但野生型组干扰素和炎症反应通路富集显著更高。

四、讨论与结论总结

本研究通过结构和生化方法定义了狂犬病病毒属糖蛋白结构域III（PHD）上一个被广谱中和抗体A6和F11靶向的保守表位。该表位在系统发育群I内高度保守，解释了两种抗体在该群内的广谱中和能力；系统发育群I外病毒中该区域的替换可能破坏关键相互作用，导致中和失败。A6/F11结合位点代表了糖蛋白上一个此前未充分认识的易感区域，与RVC20结合表位不同。A6与融合前构象的兼容性及与融合后构象的不兼容性强烈提示，这些抗体通过稳定融合前状态、阻断膜融合所需构象变化来发挥中和作用。

在体内疗效方面，A6对CNS驻留性狂犬病病毒属感染的治疗效果与F11既往观察高度相似，但第7天治疗的挽救效率F11优于A6（83%对33%）。A6和RVC20虽体外中和效力相当，但体内疗效动力学特征不同：A6在第5天给药时效果最佳（100%存活），RVC20在第7天效果最佳（100%存活），而第9天给药RVC20优于A6（67%对17%）。A6治疗动物功能恢复趋势更好。A6对当前流行犬源RABV株Ken-1感染在第5天给药时挽救100%动物，表明其在临床前环境中对当前流行毒株有效。

转录组学分析表明，ABLV感染与强烈的炎症和抗病毒反应相关，A6治疗高效抑制这些反应。但减毒G(K245E)病毒感染实验显示，尽管诱导的炎症基因特征与野生型高度相似，感染动物仍存活，证明神经炎症虽然存在，但不是致死结局的充分预测指标。这支持A6治疗效应机制超出单纯抑制炎症反应的结论。

总体而言，外周给予A6及类似中和性mAb通过抑制G蛋白融合前至融合后转变和调控神经炎症，促进CNS驻留性狂犬病病毒属感染后的存活和长期功能恢复。