《Artificial Cells, Nanomedicine, and Biotechnology》：Comprehensive analysis of the single-cell and transcriptomics uncovers the pathogenic network and potential biomarkers related to hypoxia, metabolic reprogramming and atherosclerosis in obstructive sleep apnoea
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本研究旨在通过分析RNA-seq（GSE75097：6例对照和42例阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征（OSA）患者）和单细胞RNA-seq（scRNA-seq）（GSE214865：11例对照和11例OSA患者）数据集，识别OSA的关键生物标志物。差异表达分析揭
本研究旨在通过分析RNA-seq（GSE75097：6例对照和42例阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征（OSA）患者）和单细胞RNA-seq（scRNA-seq）（GSE214865：11例对照和11例OSA患者）数据集，识别OSA的关键生物标志物。差异表达分析揭示了OSA组与对照组之间的575个差异表达基因（DEGs）。利用加权基因共表达网络分析（WGCNA）结合机器学习方法（随机森林（RF）、支持向量机递归特征消除（SVM-RFE）和最小绝对值收敛和选择算子（LASSO）），研究人员鉴定出四个枢纽基因（C17ORF91、HBEGF、PGBD2和ZNF616）作为候选生物标志物，其显示出探索性的区分性能（曲线下面积（AUC）>0.7）。基因集富集分析（GSEA）表明，这些基因与缺氧反应、动脉粥样硬化和代谢重编程（标准化富集分数（NES）低至-2.049，校正后p<.05）以及免疫调节（NES高达1.932，校正后p<.05）相关的通路有关。单细胞RNA测序分析进一步证明，经典型单核细胞（cMonocytes）在OSA进展中发挥核心作用，其在缺氧、代谢功能障碍和动脉粥样硬化风险方面表现出最高评分。一个纳入这些枢纽基因的探索性列线图在发现队列中显示出良好的内部性能。这些发现为OSA相关的分子特征提供了产生假说的见解，并将这些基因确定为需要独立外部和功能验证的候选生物标志物。对这些基因的进一步验证可为评估其在OSA中潜在的诊断和治疗相关性提供基础。
研究背景与目的
阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征（OSA）是一种常见的上呼吸道疾病，其特征是睡眠期间上气道反复塌陷，导致呼吸暂停和低通气事件，进而引发低氧血症、高碳酸血症和睡眠结构碎片化。OSA不仅是心血管疾病的独立危险因素，还与糖尿病、脑血管疾病、精神疾病及多种癌症的发病率和死亡率升高密切相关。全球超过9亿人受OSA影响，其中约40%为中重度患者。尽管多导睡眠监测（PSG）是诊断的金标准，但目前仍缺乏可靠的分子生物标志物用于早期诊断、风险分层和个体化治疗。OSA的发病机制极为复杂，涉及慢性间歇性缺氧（CIH）、交感神经激活、全身性炎症及免疫失调等多重病理过程，而传统的全组织转录组分析无法揭示特定细胞类型的分子变化。因此，本研究旨在通过整合全转录组和单细胞转录组数据，结合机器学习算法，识别与OSA发病网络密切相关的关键基因和细胞亚型，为寻找新的诊断标志物和治疗靶点提供依据。
研究方法与技术路线
研究人员从基因表达综合数据库（GEO）获取了成人全转录组数据集GSE75097（包含6例原发性打鼾对照和28例未经治疗的OSA患者）以及儿童单细胞转录组数据集GSE214865（包含11例对照和11例OSA患儿）。主要技术方法包括：1）利用“limma”包筛选差异表达基因（DEGs）；2）采用加权基因共表达网络分析（WGCNA）识别与OSA表型高度相关的基因模块；3）联合三种机器学习算法——随机森林（RF）、支持向量机递归特征消除（SVM-RFE）和最小绝对值收敛和选择算子（LASSO）逻辑回归——进行特征筛选，取交集确定枢纽基因；4）运用基因集富集分析（GSEA）探讨枢纽基因的功能通路；5）应用CIBERSORT算法评估免疫细胞浸润情况；6）利用Seurat包和SingleR包对scRNA-seq数据进行降维、聚类和细胞类型注释，并通过AddModuleScore算法计算各细胞亚型的枢纽基因评分（Hgscore）、缺氧评分、代谢重编程评分及动脉粥样硬化风险评分。
研究结果
1. 差异表达基因（DEGs）与功能富集分析
研究人员在OSA组与对照组间鉴定出575个DEGs（169个下调，406个上调）。基因本体论（GO）分析显示这些基因富集于有丝分裂调控、嗅觉感知、离子转运等生物学过程。京都基因与基因组百科全书（KEGG）分析则提示它们参与嗅觉转导、鞘脂代谢和丙酸代谢等通路。
2. 加权基因共表达网络分析（WGCNA）与共有基因
通过WGCNA，研究人员构建了无尺度拓扑网络（软阈值β=2，R2=0.981），识别出11个共表达模块。其中，MEgrey60模块与OSA呈最显著正相关（cor=0.38，p=.02）。将该模块内的117个基因与DEGs取交集，获得11个共有基因。
3. 机器学习筛选与枢纽基因评价
比较RF与SVM-RFE的性能后，研究人员选用RF并结合LASSO回归进行特征筛选。两种方法取交集得到5个候选基因（BHLHB9、C17ORF91、HBEGF、PGBD2、ZNF616）。表达验证显示，C17ORF91和HBEGF在OSA组中表达降低，而PGBD2和ZNF616表达升高。受试者工作特征（ROC）曲线分析表明，C17ORF91（AUC=0.8095）、HBEGF（AUC=0.7738）、PGBD2（AUC=0.7560）和ZNF616（AUC=0.7560）均具有大于0.7的区分效能，而BHLHB9（AUC=0.6488）未达标准，故最终选定前四个基因为枢纽基因。
4. 探索性列线图构建
基于上述四个基因的表达水平构建了列线图，其校准曲线显示预测概率与观测概率一致性良好，决策曲线分析（DCA）表明在较宽的阈值概率范围内具有净获益，临床影响曲线也展示了良好的预测效能（C统计量/AUC=0.851）。
5. 单基因基因集富集分析（GSEA）
针对四个枢纽基因的单基因GSEA显示，它们均富集于免疫调节（如抗原加工与提呈、自然杀伤（NK）细胞介导的细胞毒性）、氧化还原与代谢（如谷胱甘肽代谢、嘌呤代谢）以及细胞粘附与骨架重塑相关通路。
6. 免疫细胞浸润分析
CIBERSORT分析提示OSA组中M2型巨噬细胞和活化肥大细胞的比例较对照组降低。此外，四个枢纽基因与多种浸润免疫细胞之间存在相关性。
7. 单细胞RNA测序分析
经过严格质控，共获得55,989个对照细胞和52,387个OSA细胞，聚类后识别出16种主要免疫细胞类型。在OSA组中，多种免疫细胞的比例发生显著改变。枢纽基因的表达模式显示，C17ORF91和HBEGF主要在经典型单核细胞（cMonocytes）中高表达。通过AddModuleScore计算的枢纽基因评分（Hgscore）同样以cMonocytes最高。CellChat分析表明cMonocytes与其他免疫细胞（尤其是常规树突状细胞2型（cDC2））存在显著的相互作用强度和频率。
8. 缺氧、代谢重编程与动脉粥样硬化风险评分
在单细胞层面，cMonocytes在缺氧评分、代谢重编程评分（表现为糖酵解优势）和动脉粥样硬化风险评分中均位列前三，提示其在OSA相关缺氧应答、代谢紊乱和动脉粥样硬化进程中扮演核心角色。相关性分析显示，cMonocytes中的Hgscore与缺氧评分（R=0.064，p=1.2×10??）、代谢重编程评分（R=0.039，p=.000222）及动脉粥样硬化风险评分（R=0.039，p=.019）均呈弱但统计学显著的正相关。
讨论与结论
研究人员指出，本研究超越了以往单一分析方法，首次将全转录组、单细胞转录组与机器学习相结合，系统鉴定了OSA的分子标志物。四个枢纽基因（C17ORF91/MIR22HG、HBEGF、PGBD2、ZNF616）的发现，特别是它们在经典型单核细胞中的富集，为理解OSA的免疫代谢机制提供了新视角。C17ORF91作为一种长链非编码RNA，可能通过PI3K-Akt和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路参与缺血应激反应，这与OSA的CIH病理特征相呼应。HBEGF与表皮生长因子受体（EGFR）信号通路相关，在代谢综合征和动脉粥样硬化中发挥保护或双刃剑作用。PGBD2和ZNF616功能尚不明确，但本研究的通路关联为其潜在作用提供了可检验的假说。然而，研究人员也坦诚地指出了多项局限性：所有分析基于公共数据库，缺乏蛋白水平和功能性实验验证；样本量较小（尤其全转录组数据仅6例对照对28例OSA），可能导致偏倚和统计效力不足；单细胞数据来自儿童队列而全转录组数据来自成人队列，年龄差异可能影响跨数据集比较的可靠性；枢纽基因评分与病理评分的相关性虽显著但较弱，可能反映了复杂的非线性调控关系而非简单的线性驱动。结论部分强调，本研究鉴定出一个由C17ORF91、HBEGF、PGBD2和ZNF616组成的四基因候选标志物组合，其在经典型单核细胞中表达富集，显示出探索性的诊断效能并与OSA相关的缺氧、代谢重编程及动脉粥样硬化风险存在计算关联，为以单核细胞生物学为核心的OSA发病机制提供了产生假说的框架。但这些发现均为探索性结果，需在大规模、年龄匹配的独立队列中进行验证，并通过体内外功能实验确认其机制性作用，才能进一步评估其临床诊断和治疗转化潜力。
