火棘果富酚提取物通过调节肠道菌群、代谢组与转录组缓解DSS诱导小鼠结肠炎的研究

《Foods》：Phenolic-Rich Extract from Pyracantha fortuneana Fruit Alleviates DSS-Induced Colitis in Mice: Insights from Gut Microbiota, Metabolomic, and Transcriptomic Analyses

　　

火棘果（Pyracantha fortuneana (Maxim.) H.L.Li）果实是一种具有生物活性的膳食资源，但其对肠道炎症的影响及相关微生物、代谢和宿主反应仍不清楚。本研究对火棘果提取物进行了化学表征，并在葡聚糖硫酸钠诱导的结肠炎模型中，利用微生物组、代谢组和转录组分析评估了其保护作用。化学分析确认了火棘果提取物中含有代表性的酚酸、黄酮类和缩合单宁。在2.5%DSS暴露前后给药，火棘果提取物降低了疾病活动度，减轻了结肠缩短和脾脏指数升高，并改善了结肠组织病理学表现。火棘果提取物还降低了白细胞介素-6水平，提高了白细胞介素-10和血清谷胱甘肽过氧化物酶水平，而高剂量火棘果提取物则降低了肿瘤坏死因子-α。它恢复了紧密连接蛋白ZO-1的表达，增加了结肠二胺氧化酶水平，并倾向于增加Occludin的表达。火棘果提取物增加了微生物多样性和均匀度，减少了Turicibacter和Ruminococcus，同时增加了Prevotella和Jeotgalicoccus。非靶向代谢组学鉴定出所选盲肠胆汁酸和脂质相关代谢物的变化，而转录组和蛋白质分析提示了胆汁分泌和过氧化物酶体增殖物激活受体相关的反应，并伴随着顶端钠依赖性胆汁酸转运体、过氧化物酶体增殖物激活受体γ和核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白6表达的增加。总之，这些发现证明了火棘果提取物对DSS诱导结肠炎的保护作用，并支持其作为潜在的食品源性生物活性成分用于肠道健康的进一步研究。

研究背景

溃疡性结肠炎是一种主要累及直肠和结肠的慢性炎症性疾病，属于炎症性肠病的一种亚型。据估计，2023年全球约有500万人受UC影响，且发病率呈上升趋势。UC的常见临床表现包括便血、排便次数增多和粪便性状改变，严重影响患者生活质量，且长期患病会增加结直肠癌的风险。UC的发病机制尚未完全阐明，现有研究表明，它可能源于对有害外源物质的过度免疫反应，导致炎症加剧、氧化应激、肠道屏障破坏以及肠道菌群失调。关键的细胞因子如肿瘤坏死因子和白细胞介素在此过程中至关重要。此外，肠道屏障功能障碍，表现为黏蛋白分泌杯状细胞减少以及紧密连接蛋白如zonula occludens和Occludin减少，会进一步加重病情。肠道微生物群落对宿主健康至关重要，在UC患者中常观察到其组成紊乱，这会损害上皮屏障并扰乱免疫调节。肠道微生物产生的代谢产物是其影响宿主免疫应答的途径之一。菌群失调会改变代谢物谱，影响胆汁酸、色氨酸和短链脂肪酸的水平，这些物质通过特异性受体激活来调节免疫反应。值得注意的是，次级胆汁酸具有免疫抑制特性。结合型胆汁酸增加伴随次级胆汁酸减少，进一步凸显了微生物组成与炎症状态之间的联系。

目前UC的治疗策略，包括氨基水杨酸类药物、免疫抑制剂和生物制剂，常因副作用、高成本和频繁复发而受限。因此，人们越来越关注植物源性功能食品作为UC管理的补充方法，特别是那些富含具有抗炎和抗氧化特性的生物活性化合物的食品。其中，多酚因其能够调节炎症反应和肠道菌群而备受关注，凸显了其作为UC潜在膳食干预手段的前景。火棘是一种广泛分布于东亚和南欧的可食用植物，其果实富含多酚和其他生物活性成分。先前的研究表明，火棘果提取物具有抗氧化和代谢调节作用，包括在代谢紊乱模型中改善肠道屏障完整性和调节肠道菌群。然而，其对结肠炎的潜在作用及相关生物学反应尚不清楚。

研究目的与方法

该研究旨在评估火棘果提取物是否能限制DSS暴露小鼠的结肠损伤，并通过表征细菌群落、肠道代谢物和宿主基因表达，探究其相关的生物学反应。研究使用了雄性SPF级C57BL/6小鼠，随机分为对照组、模型组、阳性药物5-ASA组以及低、中、高三个剂量的PFE组。PFE采用70%乙醇超声辅助提取法制备。主要关键技术方法包括：1）化学成分分析：采用高效液相色谱-紫外检测法和超高效液相色谱-电喷雾电离-三重四极杆线性离子阱质谱联用法对PFE进行表征；2）动物模型构建：通过饮用水中添加2.5%DSS诱导小鼠结肠炎模型，并在DSS暴露前后分别给予PFE灌胃处理；3）肠道菌群分析：收集盲肠内容物，提取微生物基因组DNA，对16S rRNA V3-V4区进行扩增，并在Illumina NovaSeq平台测序，利用QIIME 2进行序列处理和多样性分析；4）非靶向代谢组学分析：对盲肠内容物进行代谢物提取，采用液相色谱-串联质谱法进行分析，并结合主成分分析和正交偏最小二乘判别分析进行多元统计分析；5）转录组学分析：提取结肠组织总RNA，在Illumina平台进行RNA测序，筛选差异表达基因并进行京都基因与基因组百科全书通路富集分析；6）蛋白表达验证：采用Western blotting技术检测结肠组织中ASBT、PPARγ和NLRP6的蛋白表达水平。

研究结果

1. 1.
   PFE的化学表征：通过HPLC-UV和UPLC-ESI-QTRAP-MS/MS分析，确认PFE中含有代表性的酚酸、黄酮类化合物和缩合单宁。定量结果显示，芦丁含量最高，其次为异槲皮苷、原花青素B2和原花青素B4。PFE的总酚含量为65.53 mg GAE/g DW。
2. 2.
   PFE缓解了DSS诱导的小鼠结肠炎：DSS处理显著增加了疾病活动指数评分。PFE治疗产生了剂量依赖性的DAI降低，其中高剂量PFE组在第5天和第6天的DAI评分显著低于MOD组。PFE治疗显著降低了脾脏指数，恢复了结肠长度，并减轻了结肠重量/长度比的增加。组织病理学检查显示，PFE处理组的结肠上皮和隐窝结构保存较好，炎症浸润较轻。
3. 3.
   PFE调节了DSS诱导结肠炎小鼠的炎症细胞因子和血清GSH-Px水平：DSS暴露后，血清TNF-α和IL-6显著升高，而IL-10显著降低。高剂量PFE显著降低了TNF-α水平，所有剂量的PFE均显著抑制了IL-6的升高，并部分逆转了IL-10的降低。此外，各PFE剂量均能显著提高因DSS降低的血清GSH-Px水平。
4. 4.
   PFE维护了DSS诱导结肠炎小鼠的肠道屏障完整性：免疫荧光分析显示，DSS处理显著降低了结肠组织中ZO-1和Occludin的相对荧光强度。高剂量PFE处理显著恢复了ZO-1的表达，并使Occludin表达呈上升趋势。同时，所有剂量的PFE均显著提高了结肠组织匀浆中的二胺氧化酶水平。
5. 5.
   PFE调节了DSS诱导结肠炎小鼠的肠道菌群组成：16S rRNA基因测序结果表明，PFE处理显著改变了由DSS引起的微生物群落结构。PFE显著提高了Simpson多样性和Pielou均匀度指数。LEfSe分析显示，PFE处理显著降低了Turicibacter和[Ruminococcus]的相对丰度，同时显著增加了Corynebacterium、Jeotgalicoccus、Psychrobacter和Prevotella的相对丰度。
6. 6.
   PFE调节了DSS诱导结肠炎小鼠的肠道代谢物谱：非靶向代谢组学分析共注释到1466种代谢物。KEGG富集分析突出了与脂质和胆汁酸代谢相关的通路，如硫辛酸代谢、类固醇激素生物合成、胆固醇代谢、脂肪酸代谢、初级胆汁酸生物合成、胆汁分泌和PPAR信号通路。PFE处理部分逆转了DSS引起的多种初级和次级胆汁酸水平的降低，特别是增加了murideoxycholic acid、glycine dehydrocholic acid和dehydrocholic acid的相对水平。
7. 7.
   PFE调节了DSS诱导结肠炎小鼠的结肠转录谱：转录组分析显示，PFE处理使DSS改变的基因表达模式部分恢复至接近CK组。在MOD组与PFE组之间共鉴定出1155个DEGs。KEGG富集分析表明，共享DEGs涉及胆汁分泌、PPAR信号通路、溶酶体、胆固醇代谢等通路。热图分析显示，PFE处理改变了参与胆汁分泌和胆汁酸转运的基因（如Nr1h4、Slc10a2、Slc51a、Rxra）以及与PPAR信号通路和脂质代谢相关的基因（如Pparg、Ppara、Fabp6、Acaa1b、Hmgcs2、Cd36）的表达模式。
8. 8.
   PFE与ASBT/PPARγ/NLRP6相关蛋白表达的变化有关：Western blotting结果显示，DSS处理显著降低了结肠组织中ASBT、PPARγ和NLRP6的蛋白水平。PFE处理则显著上调了这三种蛋白的表达，尽管其水平仍低于CK组。

讨论与结论

讨论部分指出，PFE缓解了DSS诱导结肠炎的临床和病理表现，其保护作用与调节炎症反应、氧化应激反应和肠道屏障功能相关。PFE改善了微生物多样性和组成，特别是降低了与炎症相关的Turicibacter和[Ruminococcus]，增加了与多酚和纤维饮食相关的Prevotella等菌属。代谢组学分析显示PFE改变了胆汁酸和脂质相关代谢物谱，转录组和蛋白水平分析则提示PFE可能通过调节胆汁分泌和PPAR信号通路发挥作用。研究也指出了局限性，包括仅在高剂量PFE组进行多组学分析、样本量较小、仅使用雄性小鼠、代谢物为推定注释、未评估加热对提取物的影响以及预处理设计主要支持预防性而非治疗性评估。未来需进行更大规模研究、靶向胆汁酸分析、菌群干预和通路特异性干预以阐明机制。

研究结论如下：总之，富含酚类的PFE可减轻DSS诱导的小鼠结肠炎，表现为疾病活动度降低、结肠形态改善、炎症细胞因子调节以及肠道屏障相关参数的部分改善。PFE处理还与肠道微生物多样性和组成、盲肠胆汁酸和脂质相关代谢物谱以及涉及胆汁分泌和PPAR相关通路的结肠分子反应的变化有关。综上所述，这些发现表明微生物、代谢和宿主反应可能参与了PFE的保护作用，尽管现有数据并未建立这些变化之间的因果关系。需要进一步的靶向代谢物定量和功能性干预研究来确定主要的活性酚类成分并验证所提出的机制。这些发现为将PFE作为一种潜在的植物源性生物活性成分用于肠道健康的进一步研究提供了实验支持。