联合高压均质-超声预处理构建鹰嘴豆蛋白微凝胶-绿豆皮可溶性膳食纤维Maillard共轭物及其功能提升与Pickering乳液稳定性增强

《Foods》：Improved Functionality and Emulsifying Stability of Chickpea Protein Microgel–Mung Bean Hull Fiber Conjugates via Combined Physicochemical Pretreatment

　　

天然鹰嘴豆蛋白分离物（chickpea protein isolate，CPI）的溶解性和分散性不理想，限制其界面性能和乳液稳定能力。研究人员对CPI凝胶进行高压均质与超声联合预处理以制备CPI微凝胶颗粒（CPI microgel particles，CPIMPs），随后与绿豆皮可溶性膳食纤维（mung bean hull soluble dietary fiber，MSDF）进行Maillard共轭。随后，评估糖基化CPIMP–MSDF共轭物对结构性质、功能性质和乳液稳定性的影响。结果表明，在蛋白与多糖质量比4:1时，CPIMP–MSDF共轭物接枝度达到峰值35.54%，表明接枝高效。傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared，FTIR）、内源荧光光谱和游离巯基含量分析证实了结构变化。研究发现，糖基化显著增强共轭物的抗氧化活性、起泡性能和乳化能力。CPIMP–MSDF共轭物的乳化活性指数（emulsifying activity index，EAI）和乳液稳定性指数（emulsion stability index，ESI）分别比CPI高2.52倍和2.91倍。由CPIMP–MSDF共轭物稳定的Pickering乳液具有最小液滴尺寸（4.72 μm）和最低zeta电位（?30.71 mV）。此外，糖基化显著增强Pickering乳液的储藏稳定性和热稳定性。这种联合物理预处理和Maillard共轭为提高豆类蛋白功能属性提供了一种可行策略。

研究背景与问题：植物基蛋白因可持续性和多功能性成为动物蛋白替代物。鹰嘴豆是全球第三大栽培豆类，蛋白含量为14.9–24.6%；鹰嘴豆蛋白分离物（CPI）氨基酸谱较平衡、生物利用度较好，是功能性食品开发中具有潜力的植物基蛋白配料。但CPI主要由球蛋白、清蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白组成，其中球蛋白占53%–60%，分子呈高度紧密、刚性的球状构象，水中解折叠能力和溶解度不足；天然球状CPI的疏水侧链多包埋于分子内核，限制其在油水界面的快速吸附与构象重排，界面活性不足，难以有效稳定乳液并影响环境耐受性。现有改性包括冷等离子体、高压均质、超声、酰化、脱酰胺、糖基化和酶解等，其中Maillard糖基化因共价结合和环境友好而受关注。天然CPI反应性氨基可及性低，接枝效率受限；超声可诱导蛋白解折叠并暴露反应性氨基，高压均质可破坏蛋白聚集体并改变构象，但顺序高压均质与超声联合制备CPI微凝胶以提高接枝效率的报道较少。MSDF含阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、果糖等，可提供Maillard反应所需还原羰基，并含类黄酮和多酚等生物活性物。基于此，研究人员将CPI制为凝胶，再经高压均质和超声联合预处理获得CPIMPs，并与MSDF进行Maillard共轭，系统评价结构、功能和Pickering乳液稳定性。结论是糖基化CPIMP–MSDF共轭物显著改善结构、功能与乳化性能，为提升豆类蛋白功能属性和开发天然乳化剂提供了可行策略。

关键技术方法：以CPI和绿豆皮为原料，CPI经热处理、TGase诱导形成凝胶，再经高速剪切、高压均质（45 MPa，5次）和超声（200 W，40 min，5 s开/3 s关）联合预处理制备CPIMPs；用纤维素酶、木瓜蛋白酶和淀粉葡糖苷酶提取MSDF；在pH 10、95 °C、6 h条件下进行湿法加热Maillard反应，制备不同质量比的CPIMP–MSDF共轭物；用OPA法、褐变强度、zeta电位、粒径、FTIR、内源荧光和游离巯基表征结构；测定DPPH^•清除、EAI/ESI和起泡性；制备O/W Pickering乳液并进行CLSM、光学显微、粒径/zeta、流变及储藏和热稳定性分析。样本来源：CPI购自陕西禹泰生物技术有限公司（西安，中国），绿豆皮源自洛阳新农村蔬菜食品有限公司（洛阳，中国）。统计分析采用SPSS 18.0，单因素或双因素ANOVA及Duncan检验。

研究结果：
3.1 结构表征
3.1.1 接枝度与褐变强度：通过OPA法和吸光度测定发现，CPIMP–MSDF共轭物接枝度随多糖比例增加先升后降，在CPIMP与MSDF质量比4:1时达峰值35.5%，表明联合预处理促进CPI构象展开并提高接枝。A₂₉₄、A₃₀₄和A₄₂₀随MSDF比例增加而升高，A₂₉₄高于A₄₂₀，说明反应体系以早期Maillard产物为主，超声预处理一定程度上抑制中间产物聚合而降低褐变。原文指出该实验设计尚不能完全区分均质或超声单独贡献。
3.1.2 zeta电位与粒径：通过zeta电位和粒径分析发现，4:1共轭物具有较高绝对zeta电位26.68 mV；共价共轭消耗更多氨基，增加蛋白分子表面负电荷，增强静电排斥。CPIMP绝对zeta电位高于天然CPI，归因于高压均质和超声形成较小蛋白聚集体并暴露更多带电基团。CPIMP–MSDF混合物在相同比例下绝对zeta电位高于共轭物。粒径分布显示，MSDF添加或接枝产生空间位阻，减少蛋白–蛋白相互作用并抑制颗粒聚集；共轭物与混合物粒径分布差异与高温孵育诱导二硫键重排及Maillard共价连接抑制无序聚集有关。
3.1.3 FTIR光谱与蛋白二级结构分析：通过FTIR发现，CPI在3750–3000 cm^?1有O–H和N–H伸缩振动宽峰，2928.46和2858.46 cm^?1对应饱和C–H伸缩，1658.74、1533.37和1238.27 cm^?1分别对应酰胺I、II、III带。CPIMP的C–O伸缩带从3296.26移至3286.61 cm^?1，酰胺I和III带红移，提示氢键增加。共轭物较混合物位移更明显，可能与糖化消耗–NH₂并生成Amadori化合物、Schiff碱和吡嗪等产物有关；1100–1020 cm^?1增强红移与C–O–C、C–O–H伸缩有关。二级结构拟合显示，CPI含21.94% α-螺旋、30.3% β-折叠、25.88% β-转角、21.87%无规卷曲；CPIMP的α-螺旋和β-折叠略降，β-转角和无规卷曲略升；共轭物α-螺旋和β-折叠显著降低，无规卷曲从21.87%增至25.47%，说明糖基化破坏原有氢键网络和疏水相互作用，促进多肽链展开，有利于界面吸附。
3.1.4 内源荧光光谱：通过内源荧光发现，CPI最大发射峰在353.07 nm，CPIMP红移至359.07 nm且强度明显降低，表明凝胶化改变蛋白构象，部分色氨酸残基移至更极性微环境。CPIMP–MSDF混合物荧光强度低于CPIMP，共轭物更低，归因于MSDF屏蔽导致蛋白荧光淬灭。共轭物荧光谱红移更明显，说明Maillard反应可能诱导更松散蛋白结构，色氨酸残基迁移至更极性亲水微环境，并伴随三级结构一定程度的解卷曲。
3.1.5 游离巯基含量：通过Ellman法测定发现，CPIMP游离巯基含量为36.97 μmol/L，高于CPI的15.97 μmol/L；高压均质剪切和超声使蛋白构象显著展开，暴露疏水核心中的半胱氨酸残基并断裂部分二硫键。CPIMP–MSDF共轭物游离巯基含量最高，与热处理及Maillard反应相关结构重排有关。

3.2 功能表征
3.2.1 DPPH^•自由基清除活性：通过DPPH^•法发现，清除活性顺序为CPI < CPIMP < 混合物 < 共轭物，共轭物达71.70%，显著高于其他样品，表明Maillard共价共轭明显增强自由基清除能力。共价接枝促进二级和三级结构展开，暴露更多反应性残基并增强供氢能力；类黑精等Maillard产物也具有抗氧化活性。CPIMP抗氧化活性高于天然CPI，混合物高于CPIMP，可能与CPIMP和MSDF协同作用、MSDF含还原糖和多酚有关。原文指出当前设计难以完全解析抗氧化活性改善的确切来源。
3.2.2 乳化性质：通过EAI和ESI测定发现，CPIMP的EAI高于CPI，归因于微凝胶制备改善水溶性和两亲性，以及软胶体颗粒的界面活性。CPIMP–MSDF混合物因MSDF增强空间位阻和静电排斥而改善乳化活性。共轭物EAI最高（57.54 m²/g），ESI最高（98.50 min），分别比CPI高2.52倍和2.91倍。机制涉及糖基化提高亲水基团含量和溶解度，促进界面迁移吸附；接枝多糖链形成较厚界面层，阻止液滴聚集和絮凝；糖基化共轭物具有更强静电排斥，增强液滴分散性和稳定性。
3.2.3 起泡性质：通过起泡性和泡沫稳定性测定发现，CPIMP–MSDF共轭物起泡性最高，达121.49%。蛋白–多糖共轭引起的结构变化增加分子间间隙和分子迁移性，多糖共价接枝提高蛋白分子溶解性和分散性，有利于泡沫形成和稳定。

3.3 CPIMP–MSDF共轭物稳定的乳液性质
3.3.1 微结构观察（CLSM）：通过共聚焦激光扫描显微镜观察发现，CPIMP、混合物和共轭物稳定乳液中红色蛋白荧光分布于绿色油滴周围，表明共价改性蛋白有效吸附于油滴表面并形成界面膜。共轭物以胶体颗粒存在于连续相，糖基化增强两亲性，形成由蛋白–多糖复合物构建的致密界面膜，并具更强空间位阻和静电排斥，有效防止液滴聚并。
3.3.2 粒径与zeta电位：通过粒径和zeta电位分析发现，新鲜CPI稳定乳液d_4,3为9.26 μm，CPIMP稳定乳液降至5.31 μm，共轭物稳定乳液最小，为4.72 μm。zeta电位由CPI的?24.86 mV降至CPIMP的?27.29 mV，共轭物最负，为?30.71 mV。粒径数据表明CPIMP–MSDF以胶体颗粒分散于水中而非可溶大分子，吸附于油滴表面形成颗粒界面屏障，体现Pickering乳液颗粒稳定机制。
3.3.3 流变学性质：通过流变测定发现，随角频率增加，G′和G″均逐渐升高，且G′在整个频率范围内大于G″，表明乳液以弹性、凝胶状为主。共轭物稳定乳液G′和G″显著高于其他样品，整体粘弹网络更强。所有乳液表观黏度随剪切速率增加而降低，表现典型剪切变稀行为；CPIMP、混合物和共轭物稳定乳液表观黏度较高，蛋白微凝胶形成及多糖链空间位阻和静电排斥有助于维持细小均匀液滴分布。
3.3.4 乳液的储藏稳定性：通过0、3、5、7、14天储藏后外观、光学显微、粒径和zeta电位分析发现，CPI乳液3天出现相分离和部分液滴聚集，14天出现明显油水分离；CPIMP、混合物和共轭物乳液在储藏期间无相分离。双因素ANOVA显示配方和储藏时间对粒径和zeta电位有显著主效应及交互作用。共轭物乳液初始d_4,3最小（4.72 μm），14天仅增至5.64 μm；zeta电位绝对值从30.71 mV降至28.99 mV，始终保持最高绝对值。CPI乳液14天粒径增至17.83 μm，zeta电位绝对值降至21.34 mV。结果表明共轭物在油滴表面形成致密稳定蛋白–多糖复合界面层，有效抑制液滴聚并。
3.3.5 加热对乳液稳定性的影响：通过25、50、75、100 °C处理3 h后测定粒径和zeta电位发现，双因素ANOVA显示配方和加热温度对粒径和zeta电位有显著主效应及交互作用。CPI稳定乳液粒径从9.26增至15.18 μm，而共轭物稳定乳液仅增加1.19 μm。热处理增强油滴布朗运动并提高碰撞频率，加速聚集或聚并；同时破坏蛋白结构并降低绝对zeta电位，削弱界面吸附和乳液稳定能力。MSDF与CPIMP共价共轭增强界面吸附，形成增厚界面膜，抑制液滴聚集并提高热稳定性。

讨论部分总结：原文讨论围绕结构–功能关系展开，联合高压均质和超声预处理使CPI构象展开、巯基暴露、表面电荷和粒径改变，为Maillard接枝提供更多反应位点；MSDF通过共价接枝及物理作用改变蛋白二级和三级结构、界面膜厚度及静电和空间排斥，从而提升抗氧化、乳化、起泡和Pickering乳液稳定性。原文同时指出，当前实验设计不能完全区分均质和超声单独贡献，也不能完全解析抗氧化活性改善来源，后续需采用单因素实验及分离定量还原糖和酚类组分。

研究结论翻译：总之，本研究评估了通过湿法加热Maillard反应形成的CPIMP–MSDF共轭物。该共轭物表现出显著改善的结构、功能和乳化性质。CPIMPs通过凝胶化后联合均质和超声预处理制备，有效改变CPI分子构象并显著提高所得CPIMP–MSDF共轭物的接枝度（degree of graft，DG）。FTIR、内源荧光光谱和游离巯基含量共同表明CPIMP与MSDF之间发生Maillard介导的共价接枝。这些结构变化调控了蛋白表面性质和界面吸附行为，导致抗氧化活性、乳化性质和起泡性质显著增强。与CPI、CPIMP和CPIMP–MSDF混合物相比，CPIMP–MSDF共轭物稳定的Pickering乳液具有最小液滴尺寸和增强的环境稳定性。总体而言，CPIMP的糖基化修饰有效提高其界面活性和乳化性能，克服天然植物蛋白结构不稳定和界面吸附能力弱等固有局限。本研究制备的CPIMP–MSDF共轭物代表一种有前景的绿色植物基乳化剂，在功能性乳液和生物活性递送系统中具有广泛应用潜力。