欧亚山茱萸果实成熟过程中挥发性化合物谱的动态演变及其成熟阶段生物标志物的鉴定

《Molecules》：Phytochemical Analysis and Biological Activities of Essential Oils from Leaves and Stems of Dicranopteris pedata (Houtt.) Nakaike

本研究旨在首次评估欧亚山茱萸（Cornus mas L.‘Bolestraszycki’品种）果实四个不同成熟阶段——未熟（绿色）、半熟（浅橙色和浅红色）及完全成熟（深红色）——挥发性化合物（VCs）的谱图特征，以确定能够描述果实成熟阶段特征的特定挥发性标志物。研究人员采用气相色谱-质谱联用（GC/MS）结合顶空固相微萃取（HS-SPME）技术研究了香气挥发性化合物的演变规律。醛类和醇类在欧亚山茱萸果实的挥发性化合物谱中占主导地位，其相对含量分别为18.2%–54.7%和20.0%–45.9%。成熟过程导致醛类相对含量显著下降（己醛降低了7倍），同时醇类含量同步增加（乙醇、丁醇相对含量升高，并出现己醇）。高含量的己醛、2-己烯醛（E）、戊醇、1-辛烯-3-醇、6-甲基-5-庚烯-2-酮、樟脑、贝壳杉烯、杜松烯、戊烷和二甲基硫醚，以及多种酯类和醇类化合物的缺失，可作为未熟果实的挥发性标志物。相反，高含量的乙醇、丁醇和己醇，以及以乙酸乙酯为主的多种酯类和乙酸含量的增加，则是完全成熟果实的特征。总之，某些挥发性化合物的存在或其相对含量可作为欧亚山茱萸果实成熟阶段的生物标志物。

论文解读：欧亚山茱萸果实成熟过程中挥发性化合物谱的动态演变及其成熟阶段生物标志物的鉴定

一、研究背景与科学问题

欧亚山茱萸（Cornus mas L.）属山茱萸科（Cornaceae），其可食用的红紫色果实呈卵形或梨形，风味独特，具有樱桃般的酸甜口感。完全成熟的果实因深红色果皮、柔软果肉和浓郁香气而被广泛用于果酱、果汁、蜜饯、果酒、利口酒及混合水果制品等加工产品。果实富含有机酸、果胶、维生素C、A、E、B?、B?、多酚、环烯醚萜类化合物、矿物质等多种营养成分和生物活性物质。果实成熟涉及一系列复杂的生理、生化和结构变化，这些变化显著影响果实的加工适宜性和品质属性。

果实香气是一个受多种途径、反应和大量挥发性有机化合物影响的复杂属性。植物中挥发性物质的生物合成是一个多步骤的动态代谢过程，其中源自不饱和脂肪酸的挥发性化合物通过脂氧合酶（LOX）途径和β-氧化途径产生。已有研究表明，果实成熟度显著影响多种水果（如桃、香蕉、苹果、草莓、树莓、芒果等）中挥发性化合物的组成和丰度。在未熟果实中，C?醛类和醇类是“青绿”果香的主要贡献者，但随着果实成熟往往急剧下降；而酯类、内酯类及部分含硫挥发性物质则随成熟度增加，成为成熟果实香气的主要贡献者。

然而，尽管对欧亚山茱萸果实的成分和营养价值已有广泛研究，但关于其挥发性化合物组成的信息极为有限。据研究人员所知，目前仅有两项研究涉及欧亚山茱萸果实的挥发性成分——一项针对成熟果实经水蒸气蒸馏后的挥发性组分及其市售果肉，另一项则分析了以成熟果实酿制的自制酒精饮料“Derenja”中的挥发性化合物。尚无研究系统考察欧亚山茱萸果实在成熟过程中挥发性化合物组成的演变规律。因此，本研究旨在首次表征欧亚山茱萸果实四个成熟阶段的挥发性化合物谱，确定可用于追踪果实成熟阶段的挥发性标志物，并同时测定可滴定酸度、可溶性固形物含量及体外抗氧化能力以评估成熟度。

二、研究设计与技术方法

研究人员于2024年在波兰Bolestraszyce的树木园和自然地理研究所（海拔230–250米，22°50′E，49°54′N）手工采集欧亚山茱萸‘Bolestraszycki’品种果实，按四个成熟阶段采样：7月21日（未熟，绿色果皮、果肉紧实，RS-1）、8月11日（半熟，浅橙色带红晕果皮、果肉紧实，RS-2）、9月1日（近熟，果皮完全变红、果肉开始软化，RS-3）和9月22日（完全成熟，果皮深红色、质地非常柔软、香气增强，RS-4）。每个阶段从5株不同植株的不同部位共采集100个果实。果实去核后均质化用于后续分析。

主要技术方法包括：可滴定酸度（TA）采用0.1 N NaOH滴定至pH 8.1终点测定，结果以每100 g果实样品中苹果酸克数表示；pH值采用电位法测定；可溶性固形物（TSS）采用阿贝折光仪测定，以°Brix表示；抗氧化活性采用ABTS•+自由基阳离子清除法在734 nm波长下测定，结果以Trolox当量（TE）表示；总酚含量（TPC）采用Folin–Ciocalteu试剂还原法在765 nm波长下测定，结果以没食子酸当量（GAE）表示。挥发性化合物采用顶空固相微萃取（HS-SPME）结合气相色谱-质谱联用（GC/MS）技术分析：5 g果肉样品置于20 mL玻璃瓶中，用三涂层纤维（50/30 μm DVB/CAR/PDMS）在40 °C下顶空萃取40 min，随后在270 °C进样口热脱附5 min。GC分离采用HP-5MS毛细管柱（30 m × 0.25 mm内径，0.25 μm膜厚），程序升温从38 °C保持10 min，以4 °C/min升至200 °C保持2 min，再以20 °C/min升至250 °C保持7 min，总运行时间62 min。MS采用电子电离（EI）模式，电离能70 eV，全扫描模式m/z 30–350。化合物通过质谱碎片模式、保留时间（RTs）和线性保留指数（LRIs）与NIST 08和Wiley 8th Edition谱库比对鉴定。统计分析采用单因素方差分析（ANOVA）和Tukey检验，多变量分析采用主成分分析（PCA）和层次聚类分析（HCA）。

三、研究结果

3.1 理化特性与抗氧化性质

可滴定酸度（TA）在果实成熟过程中逐渐增加：未熟绿色果实（RS-1）的TA最低，为6.3 g苹果酸（MA）/100 g果实干重（DW），而成熟果实显著升高（15.2和13.3 g MA/100 g DW）。RS-3至RS-4阶段TA略有下降，但仍显著高于未熟果实。果实pH值范围为3.13–3.56，从绿色（RS-1）到浅红色阶段（RS-3）pH下降，完全成熟（RS-4）时略有回升至3.35。可溶性固形物（TSS）在成熟过程中波动：从未熟绿色果实的16.8 °Brix降至RS-2阶段的11.5 °Brix，RS-3阶段略升至12.6 °Brix，完全成熟果实达到最高值18.4 °Brix。抗氧化活性方面，未熟果实表现出显著更高的ABTS•+活性（98.1 mM TE/100 g DW），是完全成熟果实（13.5 mM TE/100 g DW）的7.3倍。总酚含量（TPC）呈现类似趋势，未熟果实最高（1630 mg GAE/100 g FW），随成熟逐渐下降至367 mg GAE/100 g FW。

3.2 挥发性化合物谱

GC/MS分析在欧亚山茱萸果实顶空中鉴定出49种挥发性化合物，包括醛类（10种）、醇类（10种）、酯类（6种）、酮类（5种）、萜烯类（11种）、烃类（5种）及2种其他化合物。完全成熟果实含有的挥发性化合物数量（46种）略高于其他阶段（未熟39种，中间阶段44种）。

醛类是欧亚山茱萸果实中最丰富的挥发性化合物，相对含量占18.2%–49%。未熟绿色果实（RS-1）和浅橙色半熟（RS-2）样品的醛类总相对含量约为后期阶段（RS-3和RS-4）的2倍。三种主要醛类——己醛、2-己烯醛（E）和壬醛——在成熟各阶段分别占醛类总相对含量的25.2%–53.6%、18.4%–19%和10.3%–14.4%。C?醛类（及相应醇类）和C?醛类赋予青草或青绿香气，是未熟果实风味的主要贡献者。醛类水平随果实成熟而下降，主要归因于己醛相对含量降低了6倍。

醇类是第二大挥发性化合物类别，相对含量为18%–43.5%。完全成熟果实中乙醇（约15倍）和丁醇（12倍）的相对含量显著高于未熟果实。RS-3和RS-4阶段还检测到三种新醇类化合物，其中己醇相对含量最高达9.5%。相反，戊醇和1-辛烯-3-醇的相对含量在成熟过程中分别下降了6倍和4倍。

酯类共鉴定出6种（乙酸乙酯、乙酸丁酯、乙酸异戊酯、乙酸戊酯、丁酸丁酯和乙酸己酯），总相对含量（2.7%–23.8%）显著低于醛类和醇类。乙酸乙酯是各阶段均占主导的酯类（2%–12.6%），提供清淡果香。乙酸丁酯是第二重要的酯类，相对含量随成熟增加（0.7%–3.5%）。其他四种酯类仅在后期成熟阶段（RS-3和RS-4）检出。

萜烯类共鉴定出12种化合物。未熟绿色果实（RS-1）的萜烯类总相对含量（12.3%）显著高于完全成熟果实（2.5%）。杜松烯仅在早期成熟阶段（RS-1和RS-2）检出，相对含量4.6%–5.3%。贝壳杉烯和樟脑的相对含量也随果实成熟显著下降。

酮类在早期成熟阶段相对含量较高（总相对含量3.7%–6.9%），以6-甲基-5-庚烯-2-酮为主。烃类相对含量为2.9%–6.3%，随成熟显著下降，戊烷是主要烃类（占烃类的79%–82%）。其他挥发性物质中，乙酸相对含量随成熟增加（0.5%–3%），二甲基硫醚相对含量为2.2%–4.4%。

多变量统计分析显示，主成分分析（PCA）前两个主成分解释了总方差的93.7%（PC1占84.7%，PC2占9.0%），不同成熟阶段在PCA空间中占据明显不同的位置。层次聚类热图进一步显示，绿色（RS-1）和深红色（RS-4）阶段在大量化合物的丰度上呈现显著对比模式，浅橙色（RS-2）和浅红色（RS-3）阶段一般呈现中间谱型。

四、讨论与结论

成熟过程中最显著的变化发生在酯类组：RS-1和RS-2阶段未检出的四种新酯类（乙酸异戊酯、乙酸戊酯、丁酸丁酯和乙酸己酯）在成熟后期出现。醛类和醇类的相对含量也发生大幅变化：己醛相对含量降低6倍，而乙醇、丁醇相对含量升高并出现己醇。未熟绿色果实（RS-1）的特征是高含量的己醛、2-己烯醛（E）、戊醇、1-辛烯-3-醇、6-甲基-5-庚烯-2-酮、樟脑、贝壳杉烯、杜松烯、戊烷和二甲基硫醚，以及多种酯类和醇类（如己醇）的缺失。完全成熟果实（RS-4）的特征则是高含量的乙醇、丁醇和己醇，多种酯类（以乙酸乙酯为主）以及乙酸含量的增加。多变量分析进一步突出反式石竹烯、2-乙基己醇、古巴烯、异贝壳杉烯和1-戊烯-3-酮等与成熟阶段分化密切相关的挥发性特征，但其作为特定成熟生物标志物的潜力需进一步验证。

研究结论：据研究人员所知，这是首个记录欧亚山茱萸果实成熟过程中挥发性化合物谱的研究。研究表明，挥发性化合物组成受成熟度显著影响，因此挥发性物质可作为识别成熟阶段的实时生物标志物。特别是乙醇、丁醇和己醇相对含量的增加，以及多种酯类（主要是乙酸乙酯）的出现和乙酸相对含量的升高，表征了更高级的成熟阶段。SPME-GC/MS谱分析可为表征果实成熟度和识别与成熟相关的挥发性特征提供有用的分析手段。经进一步验证，此类挥发性特征可支持成熟度评估和采收时间优化，以及供加工用和鲜销欧亚山茱萸果实的质量评价。