《Cell Reports》：Lysosomal multi-omics reveals altered sphingolipid catabolism associated with lysosomal dysfunction in the aging brain
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脂质动态分布于细胞内多个位置，其细胞器层面的分布对功能至关重要。在脑衰老过程中，已观察到溶酶体脂质的变化，但脂质的种类、相互作用及功能意义尚未被系统表征。本研究利用质谱技术（mass spectrometry, MS）评估了小鼠皮层溶酶体组分从3月龄至24月龄
脂质动态分布于细胞内多个位置，其细胞器层面的分布对功能至关重要。在脑衰老过程中，已观察到溶酶体脂质的变化，但脂质的种类、相互作用及功能意义尚未被系统表征。本研究利用质谱技术（mass spectrometry, MS）评估了小鼠皮层溶酶体组分从3月龄至24月龄的纵向脂质组与蛋白质组变化，并采用多组学因子分析（multi-omics factor analysis, MOFA）识别驱动溶酶体衰老的潜在因子。研究数据揭示了溶酶体中脂质和蛋白质髓鞘成分随年龄依赖性增加，并提示鞘脂分解代谢发生改变，表现为优先降解鞘磷脂（sphingomyelins, SM）而非糖鞘脂（glycosphingolipids）。研究人员通过实验验证了MOFA的预测，证明年龄依赖性的髓鞘来源糖鞘脂积累与溶酶体增大及功能障碍相关，且在小胶质细胞中最为显著。研究结果表明，年龄相关的溶酶体脂质组变化与溶酶体贮积症（lysosomal storage diseases, LSDs）中观察到的现象相似，并强调了细胞器特异性分析对于阐明脂质功能的重要性。
一、研究背景与问题
大脑是除脂肪组织外脂质含量最高的器官，其独特的脂质组成对神经结构与功能具有决定性作用。脂质不仅构成细胞及细胞器膜的基本骨架，影响膜的流动性、通透性与屏障功能，还参与信号转导和脂筏形成。脂质稳态失调与脑衰老及神经退行性疾病密切相关，如APOE和TREM2基因多态性影响晚发型阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）的易感性，而年龄及疾病相关的小胶质细胞群体中常发生脂质代谢重编程。
脂质在细胞内的分布具有高度区室化特征：合成主要发生在线粒体、内质网（endoplasmic reticulum, ER）和过氧化物酶体，降解则依赖于溶酶体、线粒体和过氧化物酶体。因此，仅关注整体脂质丰度变化不足以揭示其功能意义，必须考虑细胞器特异性分布。既往研究虽已注意到衰老及神经退行性疾病脑中内体-溶酶体区室存在特定脂质积累，但积累脂质的种类、与其他生物分子的相互作用及其对细胞器功能的影响均未得到系统表征。
溶酶体是细胞分解代谢的核心枢纽，负责降解蛋白质、脂质和细胞器。年龄相关的神经退行性疾病以淀粉样β、tau、α-突触核蛋白等蛋白聚集体以及脂褐素（lipofuscin）等脂质贮积物积累为特征，提示细胞降解途径存在缺陷。自噬（autophagy）作为溶酶体依赖的分解代谢通路，其功能衰退在正常脑衰老过程中已被观察到，但具体机制尚不完全清楚。鞘脂类（sphingolipids）包括神经酰胺（ceramides, Cer）、己糖神经酰胺（hexosylceramides, HexCer）和鞘磷脂（SM）等，其积累常见于溶酶体贮积症（LSDs），由溶酶体脂质分解酶功能缺失突变导致底物堆积，进而损害溶酶体整体功能。LSDs与神经退行性疾病（尤其帕金森病和额颞叶痴呆）之间的病因学相似性已被关注，但鞘脂变化在脑衰老中的具体作用仍不明确。
基于上述背景，研究人员开展本研究，旨在通过分析3至24月龄小鼠皮层溶酶体的脂质组和蛋白质组，系统揭示脑衰老过程中溶酶体脂质变化及其功能后果，并探索潜在机制。
二、研究内容与主要结论
研究人员利用质谱技术对小鼠皮层溶酶体富集组分进行纵向脂质组和蛋白质组分析，结合多组学因子分析（MOFA）和机器学习（machine learning, ML）方法整合数据，并通过体内外实验验证预测结果。研究发现，脑衰老伴随溶酶体中髓鞘成分（脂质和蛋白质）丰度增加，以及鞘脂分解代谢平衡改变——倾向于降解鞘磷脂而非糖鞘脂。由此导致的糖鞘脂（尤其是半乳糖神经酰胺GalCer和硫苷脂sulfatides）积累，与溶酶体增大、功能障碍及自噬抑制相关，且在小胶质细胞中表现最为显著。这些变化与溶酶体贮积症（LSDs）中的脂质积累特征相似，提示年龄相关的溶酶体脂质组改变可能通过脂质依赖机制导致溶酶体功能障碍。
三、主要关键技术方法
研究人员采用多种关键技术方法：从小鼠皮层分离溶酶体，使用密度梯度离心制备批量溶酶体富集组分，以及利用LYSO-tag小鼠模型（表达HA标记的溶酶体蛋白TMEM192）结合抗HA免疫沉淀（immunoprecipitation, IP）获得神经元（Camk2a-cre）和小胶质细胞（Cx3cr1-creERT2）特异性溶酶体（Lyso-IP）。样本队列包括3、12、18、24月龄雄性C57Bl6/J小鼠，每组8只以上用于多组学分析，并设置同批次年轻对照组和混合年轻对照以控制批次效应。溶酶体样本进行基于液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）的标记-free蛋白质组学和脂质组学分析，同时进行皮层组织批量RNA测序（RNA-seq）。数据整合采用多组学因子分析（MOFA）识别共享变异因子，结合LASSO回归和随机森林回归的监督机器学习进行年龄预测和特征选择，并利用脂质本体论（LION）和基因本体论（GO）进行富集分析。实验验证包括免疫荧光、STED超分辨成像、流式细胞术、酶活性测定、Western blot及原代小胶质细胞培养等。
四、研究结果
溶酶体的分离与表征
研究人员通过密度梯度离心和Lyso-IP两种方法从3月龄小鼠皮层分离溶酶体，所有制备均显示溶酶体蛋白强富集，并确认BMP（bis(monoacylglycero)phosphate，双单酰甘油磷酸）在溶酶体制备中富集。蛋白质组分析检测到溶酶体、自噬体、内体、线粒体、突触和髓鞘相关蛋白。与自噬体相比，溶酶体制备中突触和髓鞘蛋白比例增加，线粒体蛋白减少。神经元与胶质细胞Lyso-IP存在细胞类型特异性差异：神经元溶酶体富集突触、核糖体和ER蛋白，小胶质细胞溶酶体富集内体和高尔基体蛋白。脂质组分析显示，与全皮层组织相比，溶酶体富集组分中溶血磷脂（lysophospholipids）显著富集，鞘磷脂和神经酰胺增加，而己糖神经酰胺和硫苷脂减少。
衰老过程中皮层溶酶体脂质组的变化
主成分分析（PCA）显示衰老伴随溶酶体脂质丰度的显著变化。随年龄增长，增加的脂质比例逐渐升高（12月龄53%，18月龄56%，24月龄64%）。脂质类别变化包括溶血磷脂增加、醚脂（ePC和ePE）减少，以及最显著的鞘脂类变化——己糖神经酰胺（HexCer）和硫苷脂（SHexCer）进行性积累。靶向HILIC-MS/MS分析确认HexCer主要为半乳糖神经酰胺（GalCer），即髓鞘富集的种类。此外，BMP也随年龄积累。
衰老过程中皮层溶酶体蛋白质组的变化
蛋白质组分析显示，随年龄增长，溶酶体中积累的蛋白比例增加（12月龄52%，18月龄64%，24月龄88%）。RNA-seq与蛋白质组数据缺乏整体相关性，提示溶酶体蛋白质组变化主要受转录后因素调控。GO:CC分析显示12月龄时突触蛋白富集、线粒体蛋白减少；18和24月龄时髓鞘鞘相关蛋白进行性富集，包括MOG、MOBP和PLP1。溶酶体贮积症相关蛋白如PSAP、PPT1和TPP1也随年龄积累。
多组学整合与溶酶体衰老相关因子的识别
MOFA分析产生十个因子，解释脂质数据78.6%和蛋白质数据65.2%的方差。监督机器学习（LASSO回归和随机森林回归）确定因子1和因子4最能预测年龄（R2=0.95）。因子1随年龄近单调增加，因子4呈非单调变化（18月龄达峰后下降）。因子4与甘油三酯（TAGs）和脂滴积累正相关，与早期内体蛋白减少相关。因子1与髓鞘蛋白（MOG）、溶酶体贮积症相关酶（PPT1、TPP1）、鞘脂分解酶（PSAP、ASAH1）以及HexCer、硫苷脂和BMP增加相关。
因子1分析指向鞘脂作为溶酶体衰老的潜在驱动因素
因子1的LION分析显示鞘脂（尤其硫苷脂和HexCer）是最显著增加的成分，靶向分析确认主要为GalCer。因子1蛋白包括髓鞘成分MOG、MBP、PLP1和CLDN11增加，以及溶酶体腔相关蛋白增加、线粒体相关蛋白减少。疾病本体论富集分析显示因子1与溶酶体贮积症（LSDs）正相关。
髓鞘吞噬和鞘脂分解代谢改变可能促成溶酶体脂质组改变
成像实验证实BMP在神经元和小胶质细胞中随年龄积累，STED超分辨成像确认BMP定位于溶酶体内。Western blot显示鞘磷脂分解酶SMPD1在衰老溶酶体中丰度增加，而GalCer分解酶GALC和GlcCer分解酶GBA1未变化。蛋白质组再分析显示仅saposin A和D随年龄增加，其中优先激活SMPD1的saposin D最为丰富，而优先辅助GBA1和GALC的saposin C未变化。髓鞘蛋白MOG在衰老溶酶体中积累，免疫荧光显示MOG主要积累于衰老小胶质细胞的溶酶体中，神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞受影响较小。流式细胞术证实衰老小胶质细胞中髓鞘（FluoroMyelin）和中性脂质（BODIPY）积累增加。
年龄相关的溶酶体变化与溶酶体和自噬功能障碍相关
Airyscan超分辨成像显示神经元和小胶质细胞中溶酶体总体积和超大溶酶体（>0.5 μm3）数量随年龄增加，小胶质细胞尤为显著。衰老溶酶体组分中CTSD酶活性相对降低，溶酶体酸化能力下降。体外实验表明，纯化髓鞘处理原代小胶质细胞可直接抑制溶酶体活性。自噬货物受体NBR1和SQSTM1以及自噬体相关LC3-II进行性积累，提示自噬抑制。流式细胞术证实衰老小胶质细胞中脂褐素和脂滴（PLIN2）增加，伴随溶酶体标志物LAMP1、CD68和溶酶体损伤标志物GAL3升高。溶酶体变化和自噬抑制优先出现在脂质积累水平高的小胶质细胞中。衰老小胶质细胞呈现促炎表型，体外髓鞘处理的小胶质细胞炎症标志物也增加。
五、讨论与结论
研究人员指出，脑衰老过程中溶酶体脂质组变化可能由两方面因素驱动：年龄依赖性的富含鞘脂的髓鞘成分向溶酶体递送增加，以及溶酶体鞘脂分解代谢改变——倾向于降解鞘磷脂而非糖鞘脂。整体结果是GalCer和硫苷脂的显著积累，类似于Krabbe病和异染性白质营养不良（MLD）等溶酶体贮积症（LSDs）中观察到的现象，可能导致溶酶体功能障碍和自噬抑制。研究人员推测，SMPD1丰度增加及其被BMP和saposin D依赖性激活可能促进鞘磷脂降解而非HexCer降解，导致特异性糖鞘脂积累和整体鞘脂失衡。研究还发现因子4与甘油三酯积累相关，提示溶酶体酸性脂肪酶（LAL）活性下降可能也是年龄相关溶酶体功能障碍的一部分。
研究结论：年龄相关的溶酶体脂质组变化与溶酶体贮积症中观察到的现象相似，提示糖鞘脂积累等溶酶体衰老相关因素可能为LSDs与神经退行性疾病易感性之间的遗传关联提供机制联系。研究强调了细胞器特异性分析和多组学纵向整合对于阐明脑衰老中脂质依赖机制的重要性。研究局限性包括：需进一步研究确认因果关系和识别相关机制；实验仅在雄性小鼠中进行，需验证对雌性的适用性；观察到的溶酶体脂质变化及相关机制需在人类细胞和组织中确认。
