《Biology》：Biofluid Proteomic Biomarker Discovery in a Large Animal Model of CLN2 Neuronal Ceroid Lipofuscinosis
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中文翻译：
CLN2病是一种致命的溶酶体贮积症，由溶酶体酶三肽基肽酶1（TPP1）缺乏引起，导致进行性神经退行性变及非神经元病变。尽管酶替代疗法已改善疾病管理，但客观上仍亟需能够监测疾病进展和治疗反应的分子生物标志物。本研究旨在利用CLN2病犬模型，研究脑脊液
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CLN2病是一种致命的溶酶体贮积症，由溶酶体酶三肽基肽酶1（TPP1）缺乏引起，导致进行性神经退行性变及非神经元病变。尽管酶替代疗法已改善疾病管理，但客观上仍亟需能够监测疾病进展和治疗反应的分子生物标志物。本研究旨在利用CLN2病犬模型，研究脑脊液（CSF）以及微创生物体液泪液和血浆中的蛋白质组变化，以鉴定候选疾病生物标志物。研究人员采用非靶向蛋白质组学分析，对来自未受影响对照组和CLN2患病犬在症状前期、症状期和疾病晚期阶段的生物体液进行了检测。CSF在疾病进展过程中表现出最大程度的蛋白质组改变。与细胞骨架组织、突触信号传导、溶酶体生物学、线粒体代谢、脂质稳态和炎症反应相关的蛋白质均发生显著改变。泪液与CSF表现出重叠的生物学主题，尤其涉及线粒体代谢、溶酶体功能和脂质相关通路。相比之下，血浆蛋白质组改变相对温和，但支持与细胞外信号传导、炎症和脂质代谢相关的系统性变化。综上，这些发现表明CLN2病中多种生物体液存在进行性和协调性的蛋白质组改变，可作为疾病进展的候选生物标志物。
论文解读
一、研究背景与目的
先天性代谢错误（IEMs）是一大类遗传性疾病，通常由酶缺陷引起，导致相关代谢通路受阻、毒性代谢中间产物蓄积及下游代谢物缺乏。神经元蜡样脂褐质沉积症（NCLs）是其中一组溶酶体贮积症，CLN2型NCL由TPP1基因突变引起，该基因编码可溶性溶酶体酶三肽基肽酶1（TPP1）。CLN2病通常在幼儿期发病，至青少年早期常导致死亡，症状包括认知和运动缺陷、癫痫发作及视力恶化直至失明。病理上以进行性脑萎缩、视网膜变性和神经元及非神经元组织中自发荧光脂色素异常胞内蓄积为特征。
目前CLN2病唯一获批的治疗方案是脑室内酶替代疗法，但现有疾病监测手段仅依赖临床评分量表，评估进食和运动能力、步态、语言发育、视力和癫痫发作等参数，这些指标可能不足以灵敏地反映短期治疗决策所需的早期分子水平变化。因此，迫切需要能够反映中枢神经系统病理的客观分子生物标志物。脑脊液（CSF）采集具有侵入性，而血液血浆和泪液是两种微创替代候选体液，已在多发性硬化（MS）和帕金森病等多种神经退行性疾病中报道过疾病相关蛋白质组改变。本研究旨在利用CLN2病犬模型，对CSF及微创体液泪液和血浆进行非靶向蛋白质组学分析，以鉴定疾病进展的候选蛋白生物标志物。
二、研究设计与技术方法
研究人员使用了未经治疗、专门培育的长毛迷你腊肠犬，患病犬（n=8）为TPP1基因c.325delC无义移码变异的纯合子，正常未患病犬（n=9）为野生型和c.325delC等位基因的杂合子携带者。CSF和血浆样本在三个时间点采集：症状前期（3.6–4.2月龄）、症状期（6.6–8.6月龄）和疾病晚期（9.3–11.2月龄）；泪液样本在对应症状前期和症状期时间点采集。主要技术方法包括：非靶向蛋白质组学分析，采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）数据非依赖性采集-平行累积连续碎裂（DIA-PASEF）模式，在Bruker timsTOF-Pro2质谱仪上采集数据；差异蛋白丰度分析使用edgeR包，采用负二项建模框架和拟似然F检验；功能富集分析使用g:Profiler进行基因本体（GO）分析；跨体液整合分析使用mixOmics包中的DIABLO方法，采用稀疏偏最小二乘判别分析（sPLS-DA）识别多组学特征。
三、研究结果
3.1 CLN2相关疾病进展
患病犬的神经缺陷进展与既往报道一致。4月龄（症状前期）神经检查正常；8月龄（症状期）出现明显小脑性共济失调、意向性和静止性震颤、姿势反应缺陷、肌阵挛抽动和威胁反应缺陷；10月龄（晚期）神经缺陷显著进展，癫痫发作需抗癫痫药物治疗控制，患病犬在10至11月龄间因达到终末期而实施安乐死。眼部改变包括约5月龄起视网膜结构和功能的进行性缺陷，以及后期视觉行为改变。
3.2 脑脊液蛋白改变
CSF中共鉴定到1397个蛋白。从症状前期到症状期，显著改变的蛋白数量明显增加，三个时间点分别有69、263和224个显著改变蛋白。在所有阶段均改变的蛋白包括加杜素2（ADD2）、动力蛋白轻中间链（DYNC1LI2）、胶质介导蛋白（GLDN）、神经元蛋白激酶C和酪蛋白激酶底物蛋白1（PACSIN1）、非特异性丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（PAK1）和突触结合蛋白1（STXBP1），均较对照组丰度增加，这些蛋白参与细胞骨架结构、轴突运输、细胞外组织和突触功能。载脂蛋白E（APOE）在三个时间点均显著升高。在症状期和晚期，更广泛的蛋白出现差异改变，包括神经丝轻链（NEFL）和微管相关蛋白tau（MAPT）等结构蛋白，以及溶酶体功能相关蛋白（如芳基硫酸酯酶A，ARSA）、线粒体代谢相关蛋白（如细胞色素c，CYCS）和脂质代谢相关蛋白（如TREM2）。多个14-3-3蛋白家族成员在症状期和晚期显著增加。GO分析显示，与神经元发育和信号传导、细胞组织、细胞骨架结构、囊泡介导转运和免疫/炎症反应相关的通路在疾病进展中反复富集。
3.3 血浆蛋白改变
血浆中共鉴定到331个蛋白，三个时间点分别有21、21和22个显著改变蛋白。与CSF相比，跨时间点重叠的蛋白较少。细胞色素c（CYCS）是少数持续升高的蛋白之一，在症状前期和症状期达到统计学显著。GO分析显示血浆富集通路较少，跨疾病阶段富集一致性较低，反复出现的主题包括细胞外和细胞黏附相关过程、酶和肽酶抑制剂活性，晚期阶段出现炎症反应、脂质转运、胆固醇代谢和脂肪酸稳态相关通路富集。
3.4 泪液蛋白改变
泪液中共鉴定到3705个蛋白，症状前期和症状期分别有68和87个显著改变蛋白。与溶酶体功能相关的蛋白包括半乳糖凝集素9（LGALS9）和N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶（GALNS）在两个时间点均升高。免疫和炎症相关蛋白如BPIFB2、DMBT1和SMR3A也升高。脂质代谢和转运相关蛋白如LCN15和PON2升高。线粒体代谢和细胞应激反应相关蛋白增加，其中ATP合酶F(0)复合物B1亚基（ATP5PB）在两个时间点均表现出最大幅度的变化，且在未患病对照犬泪液中检测不到。症状前期GO分析显示线粒体基质和质子转运ATP合酶复合物显著富集，多个线粒体蛋白在患病犬泪液中增加。症状期关键驱动条目包括淀粉样纤维形成、淀粉样β清除和脂质转运，溶酶体腔是第二过度代表的细胞组分。
3.5 跨体液相关性分析
DIABLO模型采用留一动物交叉验证评估分类性能，平衡错误率为4.5%（11个患病样本中10个和9个对照样本全部正确分类）。经强相关性过滤（|r|≥0.7）后，共鉴定到7520个跨泪液、CSF和血浆蛋白的成对关联。细胞骨架组织和轴突结构相关蛋白在相关对中显著富集，突触功能、囊泡运输和神经元信号传导相关蛋白也频繁出现。CSF神经丝轻链（NEFL）水平与泪液中多个溶酶体蛋白（包括ACE2、RNASET2、SGSH、LGMN、GALNS、NPC2、CTSD、IDUA和FUCA2）呈最高正相关，与血浆中少数蛋白呈正相关，与若干血浆蛋白呈负相关。
四、讨论与结论
该研究首次对CLN2病大动物模型的CSF、泪液和血浆进行了蛋白质组学表征。泪液中疾病相关升高最显著的蛋白是ATP5BP，即线粒体ATP合酶复合物的β亚基，而CLN2病和其他NCL中蓄积的溶酶体贮积物质主要成分正是该复合物的亚基c蛋白，这一发现具有特别意义。CSF中NEFL水平在症状期和晚期升高，且伴随泪液和血浆中多个蛋白的相关变化，表明NEFL升高并非孤立事件，而是发生在延伸至中枢神经系统之外的更广泛变化网络中。血浆蛋白质组未鉴定出强候选蛋白生物标志物，可能原因是血浆蛋白组成主要由肝脏、毛细血管内皮和肾脏调控，可迅速清除循环系统中的异常蛋白。跨体液和疾病阶段出现的多个相互关联生物学主题包括：溶酶体相关蛋白的改变反映持续的溶酶体应激反应和代偿性重塑；线粒体功能和能量代谢相关蛋白的一致改变提示进行性细胞生物能量学紊乱；脂质转运和膜相关过程蛋白的改变支持与溶酶体功能和神经元膜稳态密切相关的通路破坏。
研究结论：CLN2病与多种生物体液中协调的、时间依赖性的蛋白质组改变相关，反映溶酶体功能、线粒体代谢、脂质稳态和炎症反应中相互关联的破坏。作为早期候选生物标志物发现工作，这些结果需谨慎解读。相对较小的样本量需要在更大规模独立队列中验证，正交方法如靶向蛋白质组学或免疫分析将需要确认观察到的蛋白变化。未来研究将对于验证这些候选标志物并确定其在人类受试者中追踪疾病进展和评估治疗反应的效用至关重要。
