Tau病变小鼠模型中全局蛋白质相互作用网络的时间分辨重塑：整合共分级质谱与机器学习解析磷酸化依赖的多蛋白复合物动态

《Cell Reports》：Progressive remodeling of global protein interaction networks in a mouse model of tauopathy

神经退行性疾病不仅以蛋白质或细胞丢失为标志，还以先于并驱动病理的大分子相互作用网络的动态重塑为特征。在此，研究人员提出了tau病变模型中多蛋白复合物重塑的时间分辨、系统尺度图谱，整合共分级质谱（co-fractionation mass spectrometry，CF-MS）、定量磷酸化蛋白质组学和机器学习，以解码疾病进展过程中蛋白质相互作用组的磷酸化依赖性变化。该相互作用组图谱可作为研究功能组装体的资源，包括MAPT-Dpysl2和Cyfip1-actin，以及ptk2b-Kars/Dars和ptk2b-Msn-Farsb复合物，这些组装体在体内调节早期疾病表型。值得注意的是，该图谱在规模上捕获了蛋白质复合物的组成、动态和调控状态。通过揭示磷酸化如何调节大分子复合物结构和功能，这项工作强调了tau病变过程中发展的动态网络不稳定性，并建立了一个可推广的框架，用于神经退行性疾病中功能复合物的机制解析。

研究背景：阿尔茨海默病及相关痴呆（ADRD）是进行性神经退行性疾病，以突触失败、神经炎症和最终神经元丢失为特征。Aβ斑块和过度磷酸化微管相关蛋白tau（MAPT）缠结是关键病理标志。组学研究已发现脑蛋白质组架构广泛改变，包括多蛋白复合物破坏，但将蛋白水平变化与复合物功能变化关联仍困难。邻近标记需预设诱饵；热蛋白谱和dfPPI等有局限；AD进展相关蛋白组装体表征不足。研究人员开发了基于洗脱谱推断复合物（EPIC）算法和BrainMap平台，结合深度色谱分级、多重共分级质谱（mCF/MS）和机器学习解析脑组织天然蛋白复合物。本研究将BrainMap应用于PS19转基因tau病变小鼠模型，该模型表达人P301S突变MAPT，表现年龄依赖MAPT积累、过度磷酸化和神经退行。

研究开展与意义：研究人员在3、6、9月龄PS19与WT小鼠中整合mCF/MS、定量蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学，系统映射可溶性脑蛋白复合物随病理进展变化。解析4,072个可溶性蛋白复合物，追踪其动态，鉴定MAPT-Dpysl2、Cyfip1-actin、ptk2b-Kars/Dars、ptk2b-Msn-Farsb等复合物，并通过IP-MS和Drosophila验证功能。该工作揭示磷酸化调节大分子复合物架构和功能，强调tau病变中动态网络不稳定性，建立神经退行性变功能复合物机制解析框架。

关键技术方法：样本来自Wolozin Lab（Boston University）的PS19 P301S MAPT转基因小鼠和WT C57BL6小鼠，取3、6、9月龄雄性小鼠海马和皮层混合组织（WT6月组3个重复）。采用温和裂解保留天然相互作用；同一裂解物用于全局蛋白质组学、磷酸化蛋白质组学和mCF/MS；肽段用TMT-16plex标记，Orbitrap LC-MS分析。mCF/MS通过串联阴/阳离子交换色谱共分级，EPIC机器学习从共洗脱谱推断蛋白互作和复合物；用Simpson指数合并核心复合物；多组学整合计算S-score；IP-MS验证；Drosophila表达人WT MAPT（2N4R）或分泌Aβ42模型进行行为学验证；人类神经祖细胞Ptk2b抑制后IP-MS。

研究结果：
1. PS19 P301S MAPT小鼠模型中进行性MAPT病理与神经元变性：多模态分析显示6月龄皮层MC1阳性错误折叠MAPT积累，9月加剧；MAP2染色下降，提示树突退化和突触丢失。
2. 蛋白质组学确认tau病变早期分子特征：定量8,397蛋白。3月180上调/197下调，6月253/249，9月361/353。与GWAS ADRD基因重叠719个，其中161个在3月显著变化。早期富集突触翻译、RNA聚合酶II、细胞骨架组织；线粒体和突触功能下调；9月炎症、星形胶质和补体上调。
3. 磷酸化蛋白质组学揭示MAPT相关信号扰动：鉴定11,570磷酸位点，3,942蛋白。22个MAPT位点3月起持续上调，包括T181、S202、S396、S404等。3/6月分别306/403过度磷酸化，296/376去磷酸化；9月192/275。中期Dpysl2、Map1a、Dlgap2、Syn1、Bsn变化，晚期炎症和胶质。
4. 相互作用组分析揭示阶段特异性蛋白复合物重塑：mCF/MS解析4,072个预测共洗脱多蛋白组装体，超过一半在丰度、组成或连接性显著变化。
5. 多组学数据整合：Simpson指数≥0.8合并得3,419个mCID复合物。mCID111含MAPT/Dpysl2，早期持续高，ABP Actg1、Atp6v1a、Syn1、Snap91、Pkm下降，应激蛋白Aco2、Prdx1/2增加；mCID311含Cyfip1/ABPs，Abi1增加，Abi2波动，Wasf2增加、Wasf1下降；mCID413含Trappc，Rtn3在9月磷酸化增加并结合增加。
6. 具有遗传关联AD亚基的复合物：Ptk2b、Picalm和Tardbp：Ptk2b出现在多个复合物，mCID0884含Crk、Cbl、Sorbs2随病增加，Bcar1解离；mCID0228含Dpysl3、Ezr、Plec、Tppp；mCID0063含翻译调节因子、tRNA合成酶、Ythdf3，提示Ptk2b调控突触翻译。Ptk2b抑制后IP-MS验证Ptk2b-Dars-Kars、Ptk2b-Msn-Farsb等。TDP-43复合物富集RBP颗粒蛋白，Ablim1、hnRNPU、Raly磷酸化下降，TDP-43无磷酸化。
7. 通过coIP验证：MAPT、Dpysl2、Cyfip1 coIP-MS。MAPT IP回收Dpysl2等；Dpysl2 IP回收MAPT及Pfkm、Nsf、Map6、Tubb3；Cyfip1 IP与MAPT及Wasf1/2、Abi1/2、Nckap1关联。
8. Drosophila功能验证：在表达人WT MAPT（2N4R）或分泌Aβ42果蝇中测试12个候选基因。MAPT模型中10/12敲低加重，3个过表达也加重；Cyfip1过表达加重、敲低改善。Aβ42模型中6/12敲低加重，Eif4b敲低抑制Aβ42缺陷。mCID0111和mCID0311的11/12（92%）显著改变MAPT表型，7/12（58%）改变Aβ42，说明对MAPT选择性。

讨论总结：讨论强调tau病变中时间协调的分子网络重塑级联，数据公开。未表征的MAPT-Dpysl2和Cyfip1相互作用被验证。Ptk2b、Rtn3、TDP-43动态互作组与线粒体、突触、翻译过程相关。早期细胞骨架和翻译复合物重塑。局限性：mCF/MS聚焦可溶性复合物，漏掉不溶性聚集体、跨膜蛋白、不稳定复合物和核蛋白；仅雄性小鼠单一模型；共洗脱不等于直接结合，应作为资源。

结论翻译：重要的是，本研究提供了tau病变中动态可溶性蛋白复合物的综合图谱，揭示分子相互作用和调控修饰如何在疾病进展中演变。通过整合相互作用组学、磷酸化蛋白质组学和功能数据，研究人员建立了一个系统水平框架，用于理解神经退行性变背后的重连生化架构。这些发现提名了先前未识别的大分子组装体和调控节点作为候选治疗靶点，同时为AD/RD研究界提供了广泛适用的资源。