转录组学鉴定与验证NDUFS2在急性大鼠颞下颌关节（TMJ）滑膜炎中的作用及其在LPS诱导滑膜成纤维细胞炎症中的功能调控

《Journal of Inflammation Research》：Transcriptomic Identification and Validation of NDUFS2 in Acute Rat TMJ Synovitis and Its Functional Role in LPS-Induced Synovial Fibroblast Inflammation

目的：颞下颌关节（TMJ）滑膜炎持续驱动TMJ骨关节炎（TMJOA）进展。异常活性氧（ROS）蓄积触发慢性氧化应激，放大滑膜炎症。本研究旨在通过转录组筛选鉴定候选ROS相关基因，并探讨其在TMJ滑膜炎中的潜在功能参与。
方法：通过关节腔内注射完全弗氏佐剂（CFA）在雄性Sprague-Dawley大鼠中诱导急性TMJ滑膜炎。对炎症和正常滑膜组织进行RNA测序，通过将差异表达基因（DEGs）与ROS相关基因（ROS-RGs）取交集筛选目标基因。在体内和体外验证候选基因表达，并使用脂多糖（LPS）诱导的滑膜成纤维细胞（SFs）进行体外功能实验。通过小干扰RNA（siRNA）敲低或质粒过表达评估NDUFS2功能，并辅以线粒体靶向抗氧化剂Mito-TEMPO的挽救实验。评估细胞内ROS、线粒体ROS（mtROS）、线粒体膜电位（ΔΨ_m）和促炎标志物（MMP13、IL-1β、TNF-α）。
结果：通过转录组筛选，NDUFS2被鉴定为候选ROS相关基因，基因集富集分析（GSEA）将其与包括氧化磷酸化在内的信号通路联系起来。NDUFS2在炎症TMJ滑膜组织和LPS刺激的SFs中显著上调。在LPS诱导模型中，NDUFS2敲低减弱ROS/mtROS蓄积，部分恢复ΔΨ_m，并降低促炎标志物表达；而NDUFS2过表达可增加ROS/mtROS水平，降低ΔΨ_m，并升高促炎标志物表达。此外，挽救实验表明，用Mito-TEMPO清除mtROS可逆转NDUFS2介导的氧化应激和炎症。
结论：研究人员的发现通过转录组筛选将NDUFS2鉴定为与急性TMJ滑膜炎相关的关键ROS相关基因。体外证据表明，NDUFS2通过mtROS介导的线粒体氧化应激调节滑膜成纤维细胞中的炎症反应。这些发现为进一步探索TMJ滑膜炎发病机制提供了实验基础。

一、研究背景
颞下颌关节骨关节炎（TMJOA）是一种低度炎性关节疾病，以持续性关节痛和下颌运动受限为特征，病理上表现为髁突软骨进行性降解、软骨下骨重塑和慢性滑膜炎症。目前临床治疗多属姑息性，难以阻止或逆转TMJOA退变。滑膜炎由滑膜微环境改变驱动，是骨关节炎（OA）进展的关键驱动因素，而非单纯伴随表现。滑膜微环境包括滑膜成纤维细胞（SFs）、滑膜巨噬细胞和滑膜间充质干细胞。在膝关节OA中，SFs分泌IL-1β、TNF-α等促炎细胞因子和基质金属蛋白酶（MMPs），促进免疫细胞浸润、病理性血管生成和软骨基质降解。与膝关节OA相比，TMJOA患者滑液中促炎细胞因子更高、滑膜炎症更明显。活性氧（ROS）主要由线粒体呼吸链产生，既是生理第二信使，又在病理下因产生与清除失衡导致慢性氧化应激，驱动OA。ROS可激活NLRP3、NF-κB和p38 MAPK等通路，导致软骨细胞死亡和炎症；在滑膜中，ROS可激活NLRP3并促进M1巨噬细胞极化。Ye et al显示ROS/TGF-β轴诱导OA来源SFs中SOX4表达，促进衰老相关分泌表型（SASP）和细胞衰老。类风湿关节炎（RA）中，线粒体功能障碍诱导ROS蓄积激活NF-κB，增强IL-1β促炎效力。ROS/NLRP3轴介导TMJOA相关滑膜炎，导致髁突软骨细胞焦亡和基质分解；靶向ROS清除可减轻滑膜炎症和保护软骨下骨。因此，减轻滑膜微环境过多ROS是TMJOA潜在策略，但TMJ滑膜炎中ROS异常产生的上游分子机制尚不清楚。

二、研究开展与意义
研究人员建立CFA诱导的SD大鼠急性TMJ滑膜炎模型，对炎症和对照滑膜组织进行bulk RNA测序。通过DEGs与ROS相关基因（ROS-RGs）交集鉴定NDUFS2为ROS相关基因。体内外验证显示NDUFS2在滑膜炎症中特异性上调。随后用LPS诱导TMJ SFs炎症模型，系统研究NDUFS2过表达和敲低对ROS蓄积、ΔΨ_m及MMP13、IL-1β、TNF-α表达的影响。研究提示NDUFS2可能通过增加ROS蓄积和损害线粒体膜电位参与TMJ SFs促炎激活，为TMJ滑膜炎分子机制提供新见解。

三、关键技术方法
研究采用雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（7周龄，180–220 g，昆明医科大学动物中心），随机分对照和炎症组（每组18只）；炎症组双侧关节上腔注射CFA，对照注射生理盐水，7天后取材。每组4只滑膜组织用于RNA测序。关键方法包括：CFA诱导急性TMJ滑膜炎模型、H&E与Krenn评分、免疫组化（IHC）、免疫荧光（IF）、Western blot（WB）、RT-qPCR；RNA测序及DESeq2差异分析、GO/KEGG富集、MSigDB ROS相关基因交集、STRING蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）、CytoHubba最大团中心性（MCC）、GSEA、GeneMANIA；原代大鼠TMJ滑膜成纤维细胞（SFs）培养与vimentin鉴定、LPS诱导炎症、siRNA敲低、质粒过表达、Mito-TEMPO挽救、DCFH-DA检测ROS、MitoSOX检测mtROS、JC-1检测ΔΨ_m。

四、研究结果
1 CFA诱导急性TMJ滑膜炎模型建立：CFA注射后7天，炎症组TMJ区域肿胀，双侧TMJ间距显著增加；H&E显示血管扩张/新生、炎细胞浸润伴脂滴、滑膜增生；Krenn评分显著升高；IHC和WB显示MMP13、IL-1β、TNF-α表达显著升高。结论：CFA关节腔注射可有效诱导SD大鼠急性TMJ滑膜炎。

2 TMJ滑膜炎中8个ROS相关候选基因鉴定：滑膜组织全转录组测序共鉴定3580个DEGs，其中2064个下调和1516个上调；DEGs与57个大鼠ROS-RGs交集得到8个候选基因；GO和KEGG富集显示候选基因显著富集于呼吸链复合体、氧化磷酸化、NADH脱氢酶复合体组装等；NDUFS2、NDUFA6、NDUFB4在FDR<0.05水平显著。

3 关键候选基因NDUFS2鉴定：将8个候选基因输入STRING构建PPI网络，去除断开节点后得到7个互作基因网络；MCC算法确定NDUFA6、NDUFB4、NDUFS2为前三高评分关键候选基因。阈值0.40和0.70敏感性分析保留同一三基因完整网络，互作分数均>0.96。GSEA显示NDUFA6富集31条、NDUFB4 32条、NDUFS2 32条通路，共同关联氧化磷酸化、E2F Targets、Myogenesis和IL6/JAK/STAT3。GeneMANIA显示富集线粒体呼吸链和氧化还原酶复合体。功能相似性显示NDUFB4与NDUFA6强相似，NDUFS2功能独特，故选NDUFS2后续分析。

4 NDUFS2在体内外TMJ滑膜炎中显著上调：IHC和IF显示炎症滑膜NDUFS2表达显著升高，定位于滑膜衬里和髁突表面纤维层；WB显示炎症滑膜NDUFS2、MMP13、IL-1β、TNF-α蛋白升高。原代SFs经vimentin免疫荧光确认；LPS刺激12 h后WB和RT-qPCR显示NDUFS2、MMP13、IL-1β、TNF-α蛋白和mRNA均显著升高。结论：NDUFS2在CFA诱导急性TMJ滑膜炎和LPS刺激SFs中上调。

5 敲低NDUFS2减轻LPS诱导滑膜成纤维细胞炎症和线粒体氧化应激：使用siRNA-1137。非炎症下，NDUFS2敲低组总ROS和mtROS显著升高、ΔΨ_m降低，但NDUFS2、MMP13、IL-1β、TNF-α mRNA显著下调；炎症下，NDUFS2 siRNA + LPS组较对照+LPS总ROS和mtROS降低、ΔΨ_m恢复，且NDUFS2、MMP13、IL-1β、TNF-α mRNA和蛋白显著下调。第二siRNA-727结果一致。结论：炎症条件下敲低NDUFS2可减轻ROS/mtROS过度产生、恢复ΔΨ_m并抑制促炎细胞因子表达。

6 过表达NDUFS2加剧LPS诱导滑膜成纤维细胞炎症和线粒体氧化应激：非炎症下，NDUFS2-OE组较Vector组ROS和mtROS显著升高、ΔΨ_m显著降低；炎症下，NDUFS2-OE + LPS组较Vector + LPS总ROS和mtROS显著升高、ΔΨ_m明显去极化。RT-qPCR和WB显示NDUFS2、MMP13、IL-1β、TNF-α mRNA和蛋白在非炎症和炎症下均显著增加。结论：无论炎症或非炎症状态，NDUFS2过表达均与ROS/mtROS升高、ΔΨ_m降低和促炎细胞因子上调相关，加重LPS诱导的体外滑膜炎。

7 清除mtROS挽救NDUFS2过表达加剧的线粒体氧化应激并改善滑膜成纤维细胞炎症：用线粒体靶向抗氧化剂Mito-TEMPO清除mtROS。非炎症下，NDUFS2-OE + MT组较NDUFS2-OE组总ROS和mtROS降至近基线、ΔΨ_m恢复，MMP13、IL-1β、TNF-α mRNA和蛋白下调；炎症下，NDUFS2-OE + LPS + MT组较NDUFS2-OE + LPS组ROS和mtROS降低、ΔΨ_m恢复，促炎因子mRNA和蛋白显著降低。结论：在非炎症或炎症状态下，清除mtROS均可逆转NDUFS2过表达诱导的ROS/mtROS升高、ΔΨ_m去极化和促炎细胞因子上调，改善SFs炎症。

五、讨论部分总结与结论翻译
讨论指出，TMJOA中滑膜炎症是重要病理组分，靶向ROS介导的氧化应激是潜在策略，但滑膜炎症微环境中ROS异常产生机制不明。研究人员通过全转录组测序发现NDUFS2为DEGs与ROS-RGs交集关键基因，即线粒体复合物I核心亚基。功能富集和GeneMANIA预测及体内外验证显示，NDUFS2在炎症TMJ滑膜和LPS诱导SFs炎症模型中显著上调，与线粒体氧化应激、ROS过度蓄积及MMP13、IL-1β、TNF-α升高相关。讨论回顾NDUFA6、NDUFB4、NDUFS2作用：NDUFA6为复合物I附属亚基，参与肝脏缺血再灌注损伤中氧化还原调节；NDUFB4是二甲双胍直接分子靶点，介导能量应激卵巢癌细胞线粒体功能障碍、凋亡和铁死亡；NDUFS2为急性氧传感机制分子核心，其ROS信号参与组织缺氧反应、缺血再灌注炎症损伤和细胞膜完整性维持。NDUFS2编码复合物I核心亚基，催化NADH氧化和泛醌还原并偶联质子转运，是ATP合成和细胞能量代谢关键枢纽。既往发现NDUFS2突变或缺乏与遗传性视神经病、肺动脉高压、肝脂肪变性相关，也是扩张型心肌病保护分子；体外NDUFS2对电子传递链完整性重要，缺乏导致线粒体呼吸功能障碍和ROS爆发。但本研究显示NDUFS2在TMJ滑膜炎中高表达，研究人员认为更像恶性肿瘤代谢重编程，如胰腺癌细胞维持高NDUFS2表达以满足快速增殖代谢需求。鉴于TMJ滑膜炎中SFs呈类似RA的肿瘤样过度增殖，研究人员推测NDUFS2异常上调可能是病理性适应机制，重编程线粒体呼吸链功能以支持SFs持续病理性激活和增殖，同时加剧ROS蓄积和促炎细胞因子释放。讨论还提出NDUFS2扰动对线粒体稳态和炎症反应的影响具有背景依赖性：非炎症静息条件下，NDUFS2敲低增加总ROS和mtROS、降低ΔΨ_m，但未增加MMP13、IL-1β、TNF-α；可能因NDUFS2耗竭损害复合物I完整性、增加基础电子泄漏，产生轻度氧化应激，但不足以启动完整促炎转录程序；炎症激活通常还需琥珀酸蓄积和反向电子传递（RET）等额外代谢信号。LPS诱导炎症下，代谢重编程可能促进琥珀酸蓄积和复合物I依赖RET，后者是炎症细胞mtROS重要来源；NDUFS2敲低后ROS/mtROS降低和ΔΨ_m恢复可能反映RET相关mtROS产生减弱，进而抑制mtROS依赖促炎信号，降低MMP13、IL-1β、TNF-α并缓解炎症。该机制需通过耗氧率、细胞外酸化率、复合物I酶活性和底物水平等直接验证。相反，NDUFS2过表达在非炎症和炎症下均导致ROS/mtROS激增、ΔΨ_m显著去极化，加重线粒体氧化应激、促炎细胞因子释放和滑膜炎症。讨论还联系RA和炎症性滑膜疾病：成纤维样滑膜细胞（FLSs）在炎症刺激下线粒体代谢重编程，复合物I功能障碍可导致线粒体氧化应激和mtROS过度蓄积，促进炎症信号和促炎介质表达，维持滑膜炎症；炎症关节疾病患者滑膜存在复合物I相关线粒体功能障碍和异常氧化应激。mtROS被确定为NDUFS2介导滑膜炎症调控的关键信使，Mito-TEMPO清除mtROS可逆转NDUFS2过表达所致总ROS/mtROS蓄积、恢复ΔΨ_m并降低促炎标志物，说明无论生理稳态或炎症应激，NDUFS2均通过mtROS依赖机制调节线粒体功能并编排促炎细胞因子表达。因此，调节NDUFS2活性或特异性靶向mtROS可能是减轻滑膜炎症的有效策略。局限性包括：CFA模型为急性滑膜炎、仅7天单时间点，不能推断TMJOA进展或慢性退变；体外SFs主要用vimentin鉴定，特异性有限，不能完全排除其他间充质细胞污染，未来可用CD90或FAP-α；未进行体内NDUFS2功能干预，未来需慢性TMJOA模型和条件敲除/转基因或腺相关病毒载体关节腔递送；NDUFS2敲低在不同条件下对线粒体稳态的背景依赖性效应需直接测复合物I活性、耗氧和代谢流；未探索mtROS影响炎症介质表达的下游通路，NF-κB和NLRP3等值得研究；Mito-TEMPO挽救支持mtROS参与，但NDUFS2、线粒体功能障碍和炎症激活间精确机制尚待阐明。
结论翻译：整合全转录组筛选鉴定NDUFS2为急性TMJ滑膜炎中ROS相关候选基因。使用TMJ滑膜成纤维细胞炎症模型进行体外功能验证提示，NDUFS2可能参与mtROS介导的炎症反应。需要进一步机制研究、体内验证和转化研究以阐明其在TMJ滑膜炎中的作用。