短期过度进食会破坏健康男性的小肠屏障完整性，并激活肝脏的免疫功能

《iScience》：Short term overfeeding disrupts small intestinal barrier integrity and activates hepatic immunity in healthy men

　　### 研究亮点
- 短期营养过剩会刺激黏膜免疫反应和肠道-肝脏炎症反应。
- 膜免疫激活发生在没有细菌全身性转移的情况下。
- 部分炎症标志物在生活方式恢复正常后仍然升高。
- 多重血浆生物标志物揭示了肠道和肝脏的适应性变化。

### 摘要
肥胖与肠道屏障功能障碍和低级别炎症有关，这促使人们研究人类对营养过剩的早期适应性反应。在一种受控的“假日式”过度喂养模型中，健康男性接受了为期2周的高热量、久坐的生活方式，并在之后进行了8周的随访（ClinicalTrials.gov NCT04859322）。一项针对胃肠道吸收和细菌转移的等离子体检测显示，瓜氨酸水平升高，这与上皮吸收能力的增强一致；同时黏膜免疫活性增强，表现为抗脂多糖（LPS）免疫球蛋白（IgA）水平上升，但未观察到全身性的16S rRNA变化。过度喂养后，zonulin样信号和肝脏炎症标志物（血清淀粉样蛋白A（SAA）、C反应蛋白、白细胞介素-32）也有所增加。大多数异常在恢复常规生活方式后恢复正常，但抗LPS IgA、SAA、脂钙调素-2、细胞间黏附分子-1和血管细胞黏附分子-1的水平依然升高，表明存在部分持续的炎症反应。

### 引言
肥胖症正在以惊人的速度增长，尽管有外科手术和药物创新，但没有任何国家能够成功遏制这一趋势。然而，我们对实际生活中导致脂肪增加的初始事件知之甚少。久坐的日常生活习惯、美味且高热量的食物的普遍可获得性，以及社会对便利性的日益重视而忽视健康，都被认为是导致这一全球问题的因素。这些生活方式与肠道健康状况恶化密切相关，包括宿主-微生物失衡和肠道屏障功能受损，从而促进了全身性的低级别炎症。这三者共同导致了肠道细菌及其成分（如脂多糖（LPS）进入宿主循环的现象，这种现象被称为“代谢性内毒素血症”。我们和其他研究者已经证明，细菌转移是人类肥胖的常见特征，并且在2型糖尿病（T2D）患者和伴有代谢功能障碍的脂肪肝患者（MASLD）中，微生物在组织中的分布存在差异。这些发现强调了肠道屏障在肥胖及其相关并发症发病机制中的潜在作用。

### 图表摘要
肥胖症的发病率正在迅速上升，尽管有外科手术和药物创新，但没有任何国家能够成功遏制这一趋势。然而，我们对实际生活中导致脂肪增加的初始事件知之甚少。久坐的日常生活习惯、美味且高热量的食物的普遍可获得性，以及社会对便利性的日益重视而忽视健康，都被认为是导致这一全球问题的因素。这些生活方式与肠道健康状况恶化密切相关，包括宿主-微生物失衡和肠道屏障功能受损，从而促进了全身性的低级别炎症。这三者共同导致了肠道细菌及其成分（如脂多糖（LPS）进入宿主循环的现象，这种现象被称为“代谢性内毒素血症”。我们和其他研究者已经证明，细菌转移是人类肥胖的常见特征，并且在2型糖尿病（T2D）患者和伴有代谢功能障碍的脂肪肝患者（MASLD）中，微生物在组织中的分布存在差异。

### 结果
- 短期高热量摄入会改变上皮吸收能力，暂时增强上皮吸收能力，同时破坏小肠屏障的完整性，并激活肠道-肝脏免疫轴。
- 这种改变在恢复常规生活方式后大部分会恢复正常，但抗LPS IgA、SAA、脂钙调素-2、细胞间黏附分子-1和血管细胞黏附分子-1的水平仍然升高，表明存在部分持续的炎症痕迹。
- 这些发现揭示了短期高热量摄入如何重塑上皮、黏膜和肝脏的免疫反应，并突显了血浆生物标志物在研究肠道功能和肠道-肝脏相互作用中的重要作用。

### 图表说明
- 肥胖症的发病率正在迅速上升，尽管有外科手术和药物创新，但没有任何国家能够成功遏制这一趋势。
- 我们和其他研究者已经证明，细菌转移是人类肥胖的常见特征，并且在2型糖尿病（T2D）患者和伴有代谢功能障碍的脂肪肝患者（MASLD）中，微生物在组织中的分布存在差异。

### 总结
肥胖与肠道屏障功能障碍和低级别炎症有关，这促使人们研究人类对营养过剩的早期适应性反应。在一种受控的“假日式”过度喂养模型中，健康男性接受了为期2周的高热量、久坐的生活方式，并在之后进行了8周的随访（ClinicalTrials.gov NCT04859322）。一项针对胃肠道吸收和细菌转移的等离子体检测显示，瓜氨酸水平升高，这与上皮吸收能力的增强一致；同时黏膜免疫活性增强，表现为抗脂多糖（LPS）免疫球蛋白（IgA）水平上升，但未观察到全身性的16S rRNA变化。过度喂养后，zonulin样信号和肝脏炎症标志物（血清淀粉样蛋白A（SAA）、C反应蛋白、白细胞介素-32）也有所增加。大多数异常在恢复常规生活方式后恢复正常，但抗LPS IgA、SAA、脂钙调素-2、细胞间黏附分子-1和血管细胞黏附分子-1的水平依然升高，表明存在部分持续的炎症反应。

### 介绍
肥胖症的发病率正在以惊人的速度增长，尽管有外科手术和药物创新，但没有任何国家能够成功遏制这一趋势。然而，我们对实际生活中导致脂肪增加的初始事件知之甚少。久坐的日常生活习惯、美味且高热量的食物的普遍可获得性，以及社会对便利性的日益重视而忽视健康，都被认为是导致这一全球问题的因素。这些生活方式与肠道健康状况恶化密切相关，包括宿主-微生物失衡和肠道屏障功能受损，从而促进了全身性的低级别炎症。这三者共同导致了肠道细菌及其成分（如脂多糖（LPS）进入宿主循环的现象，这种现象被称为“代谢性内毒素血症”。我们和其他研究者已经证明，细菌转移是人类肥胖的常见特征，并且在2型糖尿病（T2D）患者和伴有代谢功能障碍的脂肪肝患者（MASLD）中，微生物在组织中的分布存在差异。

### 结论
肥胖与肠道屏障功能障碍和低级别炎症有关，这促使人们研究人类对营养过剩的早期适应性反应。在一种受控的“假日式”过度喂养模型中，健康男性接受了为期2周的高热量、久坐的生活方式，并在之后进行了8周的随访（ClinicalTrials.gov NCT04859322）。一项针对胃肠道吸收和细菌转移的等离子体检测显示，瓜氨酸水平升高，这与上皮吸收能力的增强一致；同时黏膜免疫活性增强，表现为抗脂多糖（LPS）免疫球蛋白（IgA）水平上升，但未观察到全身性的16S rRNA变化。过度喂养后，zonulin样信号和肝脏炎症标志物（血清淀粉样蛋白A（SAA）、C反应蛋白、白细胞介素-32）也有所增加。大多数异常在恢复常规生活方式后恢复正常，但抗LPS IgA、SAA、脂钙调素-2、细胞间黏附分子-1和血管细胞黏附分子-1的水平依然升高，表明存在部分持续的炎症反应。这些发现揭示了短期高热量摄入如何重塑上皮、黏膜和肝脏的免疫反应，并突显了血浆生物标志物在研究肠道功能和肠道-肝脏相互作用中的重要作用。N = 20。（E–H）血浆zonulin与选定人体测量指标的相关性。（I）HOMA-IR与抗LPS、IgA的相关性。ALAT：丙氨酸氨基转移酶；ASAT：天冬氨酸氨基转移酶；GGT：γ-谷氨酰转移酶；HbA1c：糖化血红蛋白；HDL：高密度脂蛋白；HOMA-IR：胰岛素抵抗的稳态模型评估；I-FABP：肠道脂肪酸结合蛋白；Ig：免疫球蛋白；LDL：低密度脂蛋白；LPS：脂多糖；MRS：磁共振光谱；Reg-3-alpha：再生胰岛衍生蛋白3α。斯皮尔曼相关性分析进一步显示，血浆zonulin水平与体重指数（BMI）的变化（r = 0.591，padj = 1.73 × 10?5）、全身脂肪（r = 0.702，padj = 2.08 × 10?8）、内脏脂肪质量（r = 0.674，padj = 1.13 × 10?7）以及通过HOMA-IR评估的胰岛素抵抗（r = 0.511，padj = 4.33 × 10?4）有很强的相关性（图4D–4H）。与zonulin的正相关关系相反，HOMA-IR与抗LPS IgA似乎有轻微的负相关关系（r = ?0.161）；然而，这种相关性未达到统计学意义（图4I，padj = 0.220）。肠道脂肪酸结合蛋白（I-FABP）是一种细胞质标记物，反映了肠上皮细胞的损伤和加速更替；再生胰岛衍生蛋白α（Reg-3-alpha）则指示了潘内特细胞介导的黏膜防御和上皮细胞更新，在高热量饮食后没有显著变化（图4B和4C）。这些发现表明，短期过度进食会促进细菌入侵并扰乱肠道屏障功能，但不会导致可测量的肠上皮细胞丢失或明显的上皮损伤，从而导致体内小肠暂时“漏泄”，这种状况与肥胖和胰岛素抵抗的发展呈正相关。

高热量饮食后会引发急性肝脏免疫反应。接下来，我们研究了局部小肠细菌入侵和屏障功能障碍是否会在肝脏免疫反应中得到体现。为此，我们测量了急性期蛋白质高敏感性C反应蛋白（hsCRP）和血清淀粉样蛋白A（SAA）作为肝脏免疫的标志物。除少数参与者的数值符合亚临床感染（hsCRP、SAA >10 mg/L）外，整个队列的基线SAA和hsCRP水平较低，证实了他们的健康状态。过度进食在2周内导致SAA增加了约2.5倍（图5A，padj = 0.024），同时hsCRP也有所升高（图5B，padj = 0.029），表明存在急性炎症反应。这一现象还得到了白细胞介素-32（IL-32）短暂升高的支持，IL-32是一种与肝脂肪变性和肝损伤相关的生物标志物（图5C，padj = 0.023）。尽管在8周的随访期间SAA、hsCRP和IL-32有所下降，但在一些个体中SAA仍然升高，中位数增加了约70%（从1.08 mg/L上升到1.85 mg/L）。进一步支持持续炎症信号的是，血浆脂钙调素-2（LCN-2）、细胞间粘附分子-1（ICAM-1）和血管细胞粘附分子-1（VCAM-1）在参与者恢复正常生活方式后继续升高或保持高水平（图5D–5F），其中VCAM-1在8周随访时中位数增加了约35%。相比之下，一系列促炎和抗炎细胞因子（IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12p70、IL-17A、IL-18、IL-22、TNF-α和IFN-γ）没有显示出一致且有意义的变化，尽管个体间和个体内存在较大差异（图S2）。

总体而言，这些数据表明，短暂的高热量过度进食会引发协调的肠道-肝脏反应，其特征是急性肝脏激活以及更持久的内皮和中性粒细胞相关炎症信号，即使在恢复到惯常生活方式后也是如此。

尽管预计到2050年超重和肥胖将影响超过一半的全球成年人群，但我们对人类对营养过剩的最早胃肠道适应仍知之甚少。在这项受控的人类过度进食研究中，我们发现健康男性在2周的高热量、久坐生活方式下，小肠屏障功能迅速且可逆地受到影响，并激活了肠道-肝脏免疫轴。具体来说，我们观察到与上皮吸收能力增强（瓜氨酸）、小肠通透性增加和黏膜入侵（zonulin、抗LPS IgA）以及协调的肝脏急性期反应（SAA、hsCRP和IL-32）一致的生物标志物特征，即使在恢复到惯常生活方式后，这些标志物在几周内仍保持升高。我们的发现可以从三个相互关联的方面进行概念化：（1）上皮适应；（2）屏障功能障碍和黏膜免疫激活；（3）肝脏和血管免疫反应。首先，血浆瓜氨酸的增加表明吸收能力增强，可能是对高热量饮食的适应性反应。这种适应反应可能涉及形态学变化，包括绒毛高度增加或通透性改变，最终促进营养吸收和瓜氨酸合成。随着时间的推移，这些适应可能支持肥胖的发展。高热量干预后GLP-2水平的下降趋势（padj = 0.07）表明上皮细胞更替和再生能力暂时减弱，尽管需要基于活检的研究来确认这一机制。来自小鼠模型的证据，包括西方饮食暴露，支持上皮细胞更新受损和潘内特细胞功能受损是营养过剩的早期后果。其次，我们发现短期过度进食增加了抗LPS IgA，而不会影响抗LPS IgG，表明细菌入侵仅限于黏膜层面，而非系统性扩散。同时，血浆zonulin水平翻倍，并与BMI、内脏脂肪质量和HOMA-IR的变化强烈相关，这与小肠屏障功能障碍以及先前关于肥胖和屏障相关疾病患者zonulin水平升高的报告一致。值得注意的是，zonulin作为生物标志物的实用性一直存在争议，因为市售的ELISA试剂盒可能检测到错误的肽序列而不是原始描述的zonulin分子。因此，提出了“zonulin家族蛋白”这一术语来涵盖同源序列；但其重新定义仍不明确且概念模糊。尽管需要进一步研究，但我们观察到了一个生理上连贯的模式：高热量进食后急剧增加，随后在随访时完全恢复正常。鉴于zonulin是在微生物刺激下由肠上皮细胞分泌的，这种动态行为以及抗LPS IgA的增加支持了一个模型，即急性过度进食会促进黏膜细菌入侵，作为早期肠道屏障功能障碍的反应。模式相似性但幅度差异与预期的一致性（zonulin）和较慢的适应性免疫动态（IgA）相对应。第三，系统内毒素血症相关的生物标志物，如血浆LBP和白细胞外套层中的细菌负荷保持不变，大多数血浆细胞因子也是如此，进一步支持了主要局限于肠道的适应。然而，肝脏急性期蛋白质hsCRP和SAA在高热量饮食后随时间增加，其中一些参与者在随访时SAA仍然升高。虽然这些标志物的显著增加通常与感染和强烈的炎症刺激相关，但此处观察到的较为温和的升高则提示代谢功能障碍和早期脂肪变性。IL-32是一种最近描述的肝脏表型改变和代谢性脂肪性肝病的严重程度的标志物，也表现出短暂升高。与这些主要是短暂的反应相比，血浆ICAM-1、VCAM-1和LCN-2在参与者恢复到惯常饮食后仍然升高或继续增加，表明即使是短期的高热量、久坐生活方式也可能导致持久的内皮和中性粒细胞相关炎症改变。ICAM-1和VCAM-1在白细胞迁移和内皮炎症中的作用，以及LCN-2在中性粒细胞活性和肠道炎症中的作用，进一步支持了这一解释。ICAM-1、VCAM-1和LCN-2的持续升高尤其值得注意，因为体重和多个代谢参数仅在8周内部分恢复到基线水平。这种模式表明，现实生活中常见的短暂“度假式”过度进食和不活动可能会逐渐导致免疫代谢重塑。然而，我们不能排除部分持续升高的ICAM-1/VCAM-1反应是对先前COVID-19疫苗接种的反应，因为该研究是在丹麦广泛使用这些疫苗的疫情期间进行的。

总之，我们的研究结果表明，健康男性在2周的高热量、久坐生活方式足以暂时损害小肠屏障完整性，增强黏膜免疫激活，并触发肝脏和血管炎症反应，其中一些特征在急性期后仍然存在。这些结果强调了人类肠道-肝脏轴对短暂现实世界过度进食的敏感性，并突显了血浆衍生生物标志物在监测肠道完整性和其心脏代谢后果方面的潜力和复杂性。

本研究的潜在局限性在于仅关注男性受试者。虽然仅包括男性在生物变异性和队列同质性方面具有优势，但也限制了结果的普遍性，因为性别特定的反应可能无法完全捕捉。然而，在这种设置中包含女性本质上是困难的，因为月经周期期间的低度炎症变化会干扰我们的终点，而且女性通常不愿意自愿增加约5%的体重，从而影响预期的退出率。相对较小的样本量（n = 20）结合短的干预和随访期可能进一步限制了我们检测细微或延迟效应的能力，也排除了进行稳健的亚组分析的可能性。本研究的额外限制还包括缺乏对肠道功能的补充验证，包括肠道采样和粪便频率测量。特别是考虑到饮食摄入，尤其是纤维摄入，可能会影响肠道传输时间、粪便体积和微生物群组成。尽管有饮食纤维摄入数据，并且在高热量饮食干预期间显示摄入量较低，但这些数据在结果解释中没有得到正式评估或考虑。这限制了对区域化适应的机制理解，并排除了在研究期间评估胃肠道动态的能力。还值得注意的是，准备的膳食盒遵循了推荐的营养成分组合，没有强调食用高度加工食品，因为已知这些食品会加剧代谢和炎症效应。因此，未来的研究应检查高热量、超加工饮食，并延长随访期，包括对小肠和大肠的区域特定采样，并整合功能性通透性测试和组织水平读数，以剖析局部适应与循环生物标志物之间的关联。最近的数据强调了2型糖尿病（T2D）患者和非T2D患者之间肠道区域的差异，进一步需要验证在T2D和代谢性脂肪性肝病（MASLD）等代谢性疾病中是否存在类似的肠道和炎症标志物变化，其中屏障功能障碍可能起因果作用。

关于更多信息和资源的需求，请联系主要联系人Benjamin A.H. Jensen（[e-mail]）。

**材料可用性**
本研究未生成新的独特试剂。支持这些分析的去标识化数据已存放在Mendeley数据仓库中，网址为https://data.mendeley.com/datasets/3s7y3847rm/1，并在出版日期时公开可用。访问编号列在关键资源表中。
**代码可用性**
- 本文未报告原始代码。
- 任何重新分析本文报告的数据所需的额外信息都可以向主要联系人请求获得。

**致谢**
本工作主要由Novo Nordisk基金会提供的项目资助（NNF24OC0089357）和卓越新兴研究员资助（NNF21OC0066931）资助，BA.H.J. 主要负责临床研究的进行由丹麦糖尿病学院的研究资助（受Novo Nordisk基金会资助，资助编号NNF17SA0031406）以及A.P. M?ller基金会的研究资助（资助编号20-L-0061）。资助机构未参与数据整合和展示。我们感谢哥本哈根大学健康与医学科学学院的核心流式细胞术和单细胞分析设施在介观分析方面的支持和贡献。特别感谢工作人员Si B. Sonne和Samuel A. J. Trammell在实验室中的出色协助、建议和指导，以及他们在质谱数据获取和分析方面的专业知识。我们还要感谢Sébastien Benquet在zonulin、LBP、CD163和MSD检测方面提供的卓越技术支持。作者贡献包括：概念构思由N.S.N.、M.P.S.、A.B.L.和B.A.H.J.完成；数据整理由N.S.N.、N.P.和B.H.负责；正式分析由N.S.N.和H.G.-V.完成；资金筹集由B.A.H.J.和M.P.S.负责；实验设计由N.S.N.、N.P.和B.H.完成；项目管理由M.P.S.、A.B.L.和B.A.H.J.负责；数据可视化由N.S.N.完成；初稿撰写由N.S.N.、H.G.-V.和A.B.L.完成；修订和编辑工作由所有作者共同完成。M.P.S.和F.K.K.可以不受限制地访问所有研究数据。所有作者都阅读了最终版本的手稿，对其进行了审阅和批准，并对研究的准确性和完整性以及与注册方案和统计分析的符合度承担责任。

利益声明：
M.P.S.从诺和诺德 Denmark A/S和拜耳A/S获得了旅行补偿费用；从勃林格殷格海姆获得了演讲费用；F.K.K.曾任职于多个科学顾问委员会，担任演讲者代表，持有89bio、Altimmune、安进、阿斯利康、拜耳、勃林格殷格海姆、Carmot Therapeutics、礼来、Gubra、MedImmune、MSD/Merck、Mundipharma、诺和诺德、赛诺菲、Structure Therapeutics和Zucara的股份，并且是Antag Therapeutics的联合创始人及少数股东；A.B.L.曾任职于礼来和勃林格殷格海姆的科学顾问委员会，并从Zealand Pharma获得了报酬或研究支持；B.A.H.J.从Novozymes、Novonesis、Defensin Therapeutics和Zealand Pharma获得了报酬或研究支持；其余作者没有需要声明的利益冲突。

在撰写过程中使用生成式AI和AI辅助技术的情况：
在准备本文时，作者使用了AI辅助工具来改进语言和可读性。使用这些工具后，作者根据需要进行内容审查和编辑，并对出版物的内容负全部责任。

**STAR★ 方法**
**关键资源表**
**试剂或资源**
| 来源 | 标识符 |
|------------|--------------------|
| 抗体 | Anti-GLP-2-antiserum (N-terminal specific) | Hartmann等人, Code No. 92160 |
| 抗人IgA抗体 | Fisher Scientific, Cat# PA174395; RRID: AB_10985660 |
| 抗人IgG抗体 | Jackson Laboratory, Cat# 109-035-088; RRID: AB_2337584 |
| 细菌和病毒菌株 | Flagellin (Salmonella typhimurium) | Sigma-Aldrich, Cat# SRP8029 |
| 脂多糖（LPS, E.coli） | Sigma-Aldrich, Cat# L2887 |
| 生物样本 | 人血浆样本 | N/ASuppli |
| 人血细胞层样本 | N/ASuppli |
| 人血浆提取物 | Biowest, Cat# S4180-100 |
| 化学品、肽和重组蛋白 | 丙腈（HPLC级） | Honeywell-Chromasolv, Cat# 15614510 |
| 碳酸氢盐涂层缓冲液（pH 9.6） | Sigma-Aldrich, Cat# C3041 |
| 山羊血清 | Fisher Scientific, Cat# 16210064 |
| L-瓜氨酸-d4内标 | Cambridge Isotope Laboratories, Cat# DLM-6039 |
| LC/MS级乙酸铵 | Fisher Chemical, Cat# 11377490 |
| LC/MS级甲酸 | VWR Chemicals, Cat# 84865.260 |
| LC/MS级水 | VWR Chemicals, Cat# 83645.320 |
| 甲醇（分析级） | Fisher Chemical, Cat# 10284580 |
| 重组人GLP-2 | N/A | Hartmann等人 |
| I-标记的大鼠GLP-2（Asp33→Tyr33） | N/A |
| 地球L-瓜氨酸 | Apollo Scientific, Cat# BIC134 |
| 3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB） | Fisher Scientific, Cat# 002023 |
| TMB终止溶液 | Fisher Scientific, Cat# SS04 |
| Tween 20 | Sigma Aldrich, Cat# P9416 |

**关键商业检测**
| CD163 | Assay Genie, Cat# HUFI00068 |
| GLP-2放射免疫测定（RIA） | N/A | Hartmann等人 |
| 人CD14 R-PLEX单重检测 kit | Meso Scale Discovery, Cat# K151 |
| 人GLP-1 ELISA kit | Mercodia, Cat# 10-1278-01 |
| 人I-FABP R-PLEX单重检测 kit | Meso Scale Discovery, Cat# K151 |
| 人IL-18 U-Plex单重检测 kit | Meso Scale Discovery, Cat# K151 |
| 人IL-22 S-Plex单重检测 kit | Meso Scale Discovery, Cat# K151 |
| 人IL-32 R-Plex单重检测 kit | Meso Scale Discovery, Cat# K151 |
| 人LBP R-Plex单重检测 kit | Meso Scale Discovery, Cat# K151 |
| 人Reg-3-α R-Plex单重检测 kit | Meso Scale Discovery, Cat# K151 |
| U8RPGRP-S | Assay Genie, Cat# HUES0292 |
| S-PLEX促炎因子组1（人）多重检测 kit | Meso Scale Discovery, Cat# K151 |
| AKVU-Plex生物标志物组3（人）多重检测 kit | Meso Scale Discovery, Cat# K151 |

**生成式AI和AI辅助技术声明**
在准备本文期间，作者使用了AI辅助工具来提高语言和可读性。使用这些工具后，作者根据需要对内容进行了审查和编辑，并对出版物的内容负全部责任。

**数据处理声明：**
作者使用了AI辅助工具来提高手稿的语言和可读性。使用这些工具后，作者根据需要对内容进行了审查和编辑，并对出版物的内容负全部责任。

**方法**
（此处应详细描述具体的实验方法和技术细节。）

**试剂及资源**
（此处应列出所有使用的试剂和资源的详细信息，包括制造商、产品编号、包装数量等。）

**实验模型和研究参与者详情**
（此处应描述实验模型和研究参与者的基本信息。）

**伦理批准**
本研究在丹麦哥本哈根大学Herlev-Gentofte医院的临床代谢研究中心进行。所有参与者均提供了知情同意书，研究符合《赫尔辛基宣言》的最新修订版。丹麦首都地区的研究伦理委员会批准了该研究（注册号H-20036246）。

**研究设计**
研究设计已在先前文献中详细描述。简而言之，招募了20名健康的男性参与者（BMI：23 ± 1.6，年龄20–65岁），均为丹麦籍白人。他们的饮食模式符合北欧营养建议，建议每日摄入≥25–35克的膳食纤维。排除标准包括：已知肝病、糖尿病或一级亲属患有糖尿病、血浆丙氨酸氨基转移酶和/或天冬氨酸氨基转移酶水平升高（分别>140 U/L和>90 U/L）、每周饮酒量超过14单位、使用膳食补充剂，以及通过FibroScan?评估的肝纤维化或脂肪变性迹象（CAP评分>238 dB/m和/或TE>6.0 kPa），以及纤维化-4指数（FIB-4）>1.45。

**饮食干预**
参与者在研究开始后接受了为期2周的高热量饮食干预，平均每日摄入4,641千卡热量，其中碳水化合物占56%、脂肪占34%、蛋白质占9%。碳水化合物主要来自血糖生成指数中等至较高的食物，如面包、意大利面、精制米饭和果汁，平均每日摄入13克纤维。根据丹麦国家卫生委员会的指南，参与者被要求将酒精摄入量限制在每周14单位以内。此外，他们还被要求保持久坐的生活方式，避免体育锻炼，并通过活动追踪手环（Garmin Vivosmart HR）将每天的步数控制在5,000步以内。

**实验程序**
每位参与者在三次研究访视时接受了检查：基线时、2周高热量饮食干预后以及干预结束后8周（图1A）。所有研究日在禁食10小时后进行，期间避免饮水、咖啡和烟草。体成分通过生物电阻抗分析进行评估，肝纤维化和/或脂肪变性通过FibroScan?进行评估。血液收集在冷藏的乙二胺四乙酸（EDTA）管中。血液样本在4°C下以1.200 g的离心速度离心10分钟，血浆储存在-80°C直至分析。

**分析细节**
我们对之前发表的临床研究中收集的血浆样本进行了事后分析，这些分析在原始研究方案或统计分析计划中并未预先指定。

**数据分析**
**血细胞层分析**
在51个人血细胞层样本上量化了细菌16S核糖核糖核酸（rRNA）基因拷贝（图S1A），以及5个脱氧核糖核酸（DNA）提取阴性对照和三个定量对照，所有样品都以水作为起始材料。所有阴性对照的信号水平与生物样本中的信号水平相比始终可以忽略不计，证实了背景污染极低。血细胞层的样品准备和分析由Vaiomer（法国图卢兹）完成。DNA使用组织特异性技术提取，16S rRNA基因拷贝通过定量聚合酶链反应（qPCR）进行检测，重复三次，并以质粒基标准进行归一化。实时PCR针对16S rRNA基因的V3-V4区域。熔解曲线分析确保了特异性，结果以每μL液体中的16S rRNA基因拷贝数报告。

**下一代测序**
研究使用了下一代测序技术对16S rRNA基因进行测序，以识别样本中的细菌群体。工作流程包括使用针对V3-V4区域的16S通用引物进行PCR扩增，然后生成测序文库，如前所述。测序使用MiSeq Illumina技术和2 × 300 paired-end MiSeq试剂盒V3进行。基于FROGS指南的生物信息学流程分析了目标宏基因组序列。在对条形码化的Illumina配对读段进行解多路复用后，对单次读取序列进行清洗并配对成更长的片段。通过单链接聚类生成操作分类单元（OTUs），并确定分类归属。为确保数据质量，应用了特定过滤器，包括：删除读段R1的最后10个碱基、读段R2的最后40个碱基、长度小于350 nt或大于500 nt的扩增子，以及丰度低于总数据集0.005%的OTUs。

**血浆样本分析**
所有检测的生物标志物详见表1和表2。

**避免多次冻融循环**
为避免多次冻融循环，人血浆样本在分析前解冻一次，分装到适当体积后储存在-80°C（图1B）。每个检测中还包含一个混合人血浆样本（样本对照），以调整板间差异。该样本对照重复两次运行，并使用每次检测第一板的混合血浆浓度作为参考进行归一化。所有标准品也重复两次运行（图1C）。

**抗LPS、抗鞭毛蛋白（IgG/IgA）检测**：
高亲和力96孔板（Corning）分别用100 μL/孔的鞭毛蛋白（100 ng/孔；来自S. typhimurium，Sigma）或LPS（2 μg/孔；来自E. Coli，Sigma）在9.6 pH的碳酸氢盐缓冲液中过夜包被。板子用200 μL/孔的洗液（0.05%山羊血清（Fisher）和0.01% Tween 20在PBS中冲洗一次，然后加入100 μL EDTA稀释的血浆（抗鞭毛蛋白IgA/IgG - 1:100，抗LPS IgG - 1:500，抗LPS IgA - 1:200）并在37°C下孵育1小时。板子用200 μL/孔的洗液冲洗三次，然后加入100 μL/孔的抗人IgG（Jackson Laboratory）或抗人IgA（Fisher Scientific）稀释1:500并孵育1小时。板子用200 μL/孔的洗液冲洗三次，然后加入100 μL 3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB，Fisher），并在室温下避光孵育5分钟。加入100 μL TMB终止溶液（Fisher），在450 nm处读取吸光度并减去540 nm的值。由于未生成标准曲线，因此值被视为相对定量（任意单位（A.U.），考虑了每个标志物的稀释因子。

**zonulin、CD163、PGRP-S检测**：
zonulin、CD163和PGRP-S的血浆浓度使用Assay Genie（爱尔兰都柏林，目录号HUES03536、HUFI00068和HUES02920）提供的商用ELISA试剂盒根据制造商说明进行量化。

**瓜氨酸检测**
提取液通过将25 μL L-瓜氨酸-d4内标溶液（75 μm，Cambridge Isotopes）与355 μL提取溶剂（高效液相色谱（HPLC）级丙腈/分析级甲醇/MilliQ水（2:2:1）混合后加入每个试管中，并在-20°C下冷冻30分钟。然后加入20 μL血浆、水（空白）或混合人血浆样本，短暂涡旋后在-20°C下孵育30分钟。试管以最大速度离心10分钟。将360 μL上清液转移到新试管中，在速度真空干燥器中干燥后冷冻过夜。第二天向每个试管中加入100 μL提取溶剂，用旋涡混合器以1000 rpm的速度涡旋1分钟，然后以最大速度离心10分钟在室温下。将60 μL上清液转移至自动采样管中。作为质量控制池，将前50个样本的第一个和最后一个样本的各1.5 μL混合，然后短暂涡旋。所有试管储存在-20°C。质量控制标准品（0.12、4和20 μM）和标准曲线（0.15、0.5、1.5、5、15、18.75、20和75 μM）由地球L-瓜氨酸（Apollo Scientific）制备，其浓度与样本中的内标相同。每个浓度水平的质量控制标准品重复三次制备。质量控制标准和标准曲线与样本保存在同一试管中，使用与样本相同的盖子。所有样本、质量控制标准和标准品都放入预冷的（8°C）自动采样器中，并注射进行液相色谱-质谱（LC/MS）分析。样品按随机顺序注射，注射器在注射之间用2-propanol:methanol:acetonitrile:water（1:1:1:1）的混合液清洗。样品注入阿基米德1290 Infinity II UPLC Ultra-performance液相色谱（UPLC）系统，该系统连接到一个Agilent LC/Mass selective detector-XT（MSD-XT）单四极质谱仪上。瓜氨酸在加热的（35°C）Imtakt氨基酸柱（2.1 × 100 mm）上分离，流动相A为100 mM甲酸铵水溶液，流动相B为0.3%（v/v）甲酸/甲醇（95/5%（v/v）混合物。瓜氨酸及其氘代内标使用Agilent Jet Stream离子源在正模式下以176.1和180.1的质量电荷比检测。质谱仪的参数详见表S2。基于保留时间和质荷比检测到了峰值，并使用Agilent OpenLab CDS软件进行了积分处理。pmol的量是通过内部控制的标准曲线确定的，然后通过乘以悬浮液体积（100 μL）并除以注射体积（2 μL）以及提取的血浆体积（20 μL）转换为微摩尔。人血浆提取物的相对标准偏差低于15%。质量控制标准与理论浓度的差异小于15%。总体而言，重现性和准确性在15%的偏差范围内。

IL-32、CD14、LBP、Reg-3-alpha、I-FABP：IL-18、IL-32、CD14、LBP、Reg-3-alpha和I-FABP的水平是使用Meso Scale Diagnostics（MSD）（美国马里兰州洛克维尔）的特定R-Plex单plex检测试剂盒（试剂盒编号：IL32: K151AHWR, CD14: K151T1R, LBP: K151K5R, Reg-3-alpha: K151U8R, I-FABP: K151M4R）按照制造商的说明进行 quantified 的。

IL-18：IL-18的水平是使用MSD（美国马里兰州洛克维尔）的U-Plex Biomarker Group 1（人类）单plex检测试剂盒（试剂盒编号：K151VJK）进行 quantified 的。

IL-22：IL-22的水平是使用MSD（美国马里兰州洛克维尔）的S-Plex（人类）单plex检测试剂盒（试剂盒编号：K151H3S）进行 quantified 的。

hsCRP、SAA、LCN-2、ICAM、VCAM：hsCRP、SAA、LCN-2、ICAM和VCAM的水平是使用MSD（美国马里兰州洛克维尔）的U-Plex Biomarker Group 3（人类）多plex检测试剂盒（试剂盒编号：K151AGM）按照制造商的说明进行 quantified 的。

促炎 panel：IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12p70、IL-17A、TNF-α和IFN-γ的水平是使用MSD（美国马里兰州洛克维尔）的S-PLEX Proinflammatory Panel 1（人类）检测试剂盒（试剂盒编号：K15396S）按照制造商的说明进行 quantified 的。

平板读取使用MSD MESO Quick Plex SQ 120完成，数据数据分析使用DISCOVERY WORKBENCH 4.0分析软件进行处理。

GLP-1、GLP-2 测量：总GLP-1的血浆浓度是使用夹心ELISA试剂盒（试剂盒编号：10-1278-01，Mercodia，瑞典乌普萨拉）测量的；由于活性GLP-1迅速降解，总GLP-1被用作L细胞分泌的稳健替代物。完整的GLP-2是使用Hartmann等人（2000年）首次描述的放射免疫测定法测量的（Peptides, 21:73-80）。抗体（代码编号：92160）针对GLP-2的N端，因此只测量来自肠道的完全加工的GLP-2。对于标准品，我们使用了重组人GLP-2，示踪剂是经过Asp33 -> Tyr33替换的125I标记的大鼠GLP-2。所有样品在GLP-2测量前都用75%乙醇提取。

图表设计：图形摘要和示意图是使用BioRender（BioRender.com）制作的。

量化和统计分析：所有研究参与者都完成了研究，因此没有缺失数据。数据以平均值的形式呈现，并包括个别数据点以说明数据分布。数据可视化使用GraphPad Prism软件（版本10.6.1）进行。所有统计分析都是在R语言（版本4.5.2）中完成的。值比较使用LMMstar包的线性混合模型（LMM）进行。当残差偏离正态分布时，在分析前对变量进行对数转换。相关性分析使用Spearman等级相关检验进行。p值通过Benjamini-Hochberg程序进行了多重比较调整，以控制假发现率（FDR）。调整后的p值<0.05被认为是统计显著的。所有检测方法调整前后的p值概览可以在表S1中找到。相关性分析使用Spearman相关检验进行，显著相关的p值使用FDR进行了校正。

额外资源：该研究于2020年11月11日在丹麦首都地区的研究伦理委员会（注册号H-20036246）进行了前瞻性注册，首次修正于2021年1月5日；首例患者首次就诊（FPFV）发生在2021年2月8日。整个研究期间主要终点保持不变。由于行政延误，该方案于2021年4月21日在ClinicalTrials.gov（NCT04859322）上进行了回顾性注册。

补充信息（1）PDF（1.37 MB）：文件S1、图S1和S2以及表S1和S2。