基于CRISPR-dCas13a的电化学生物传感器用于灵敏检测miR-331-5p作为帕金森病的潜在生物标志物

《Analytical Biochemistry》：CRISPR-dCas13a-based electrochemical biosensor for sensitive detection of miR-331-5p as a potential biomarker of Parkinson's disease

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  首个基于CRISPR-dCas13a/EIS的miR-331-5p检测生物传感器，可作为潜在的帕金森病生物标志物。
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  该生物传感器实现了无标记、无扩增检测，线性范围为5–400 pM，检测限为7.82 pM。
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  已证明其可用于血清等真实样本的检测。

引言

帕金森病（PD）是一种进展性神经退行性疾病，其主要特征为黑质致密部多巴胺能神经元的退行性变以及神经元细胞中错误折叠的α-突触核蛋白聚集物的蓄积。临床上，PD表现为震颤、运动迟缓、肌强直和姿势不稳等运动症状，同时伴有认知障碍、睡眠障碍和自主神经功能障碍等非运动表现[1]。目前，PD是仅次于阿尔茨海默病的第二常见神经退行性疾病，全球患者超过1000万人。随着人口老龄化，其患病率预计将显著上升[2]。PD管理面临的一项主要挑战是缺乏用于早期和准确检测的可靠生物标志物。临床诊断主要基于神经系统检查和特征性运动症状，而这些症状通常在已发生大量神经元丢失之后才出现[3]。多巴胺转运体单光子发射计算机断层扫描等影像学手段虽可辅助临床评估，但费用昂贵，且不适合常规筛查[4]。因此，能够快速、微创检测的分子生物标志物仍是重要的研究重点。微小RNA（miRNA）是一类长度通常为18–22个核苷酸的短非编码RNA分子，可通过与靶信使RNA结合，在转录后水平调控基因表达[5]。miRNA参与神经元发育、突触可塑性、凋亡和神经炎症等过程，并可检测于血清、血浆和脑脊液中；其与细胞外囊泡或蛋白复合物结合的特性有助于提高其稳定性[6]。多项研究报道，包括miR-34 b/c、miR-133 b、miR-155和miR-146a在内的多种循环miRNA在PD患者中表达失调[7]。miR-331-5p也在比较性miRNA谱分析研究中，被鉴定为与PD相关分子变化相关的候选分子[8]。由于循环miRNA浓度较低，因此需要高灵敏度的分析方法。qRT-PCR因其灵敏度和特异性而被广泛使用，但该方法需要逆转录、扩增、专用仪器以及仔细的归一化处理[9]。微阵列和下一代测序技术虽可实现更广泛的谱型分析，但存在交叉杂交、成本高昂及生物信息学方面的局限[10]。电化学生物传感器具有响应快速、便携、成本低以及可与微型化设备兼容等优点[11]。由于电极界面的生物分子结合会改变可溶性氧化还原探针的电子转移电阻，电化学阻抗谱（EIS）特别适用于无标记监测[12]。CRISPR系统通过向导RNA导向的靶标结合实现可编程的核酸识别[13]。Cas13蛋白是RNA导向、靶向RNA的效应蛋白；催化失活的Cas13a（dCas13a）保留了按序列编程的RNA结合活性，但不会切割靶标[14]。此外，CRISPR/Cas13a也已与电化学微流控平台结合，用于无扩增的miRNA分析，证明了Cas13介导的识别与电化学读出之间的良好兼容性[15]。近期的研究进一步拓展了基于Cas13a的RNA传感技术：或将反式切割功能与单量子点纳米传感器耦联以用于长非编码RNA分析，或与自主G-四联体合成耦联以实现超灵敏环状RNA检测[16,17]。这些以切割为基础的体系展示了Cas13a的分析学灵活性，而本研究则采用催化失活的dCas13a作为结合元件，用于无标记的EIS检测。上述依赖切割的体系需要额外增加一步由切割介导的信号产生过程，而dCas13a可直接结合靶标，无需产生或检测切割产物，从而简化了分析流程，并可能降低由副反应性切割带来的背景干扰。近期亦已报道利用基于电化学dCas13a的平台实现直接、无标记的miRNA识别，进一步支持了将催化失活的Cas13a作为表面限域的识别元件的应用可行性[18]。近年来的进展还通过将CRISPR-Cas技术整合到DNA功能回路、双信号放大架构、crRNA稳定化策略、多模态核酸检测平台以及新兴的反抗CRISPR调控机制中，进一步拓展了该类技术的分析范围[[19], [20], [21], [22], [23]]。本研究在金电极上构建了一种基于CRISPR-dCas13a的电化学生物传感器，电极表面依次修饰MUA、PAMAM-G4、戊二醛、dCas13a以及靶标特异性sgRNA。本研究评估了该传感器对合成miR-331-5p的分析响应，并考察了其选择性、重复性、在未稀释健康人血清中的加标回收率以及储存稳定性。本文所报道的体系被提出作为一个概念验证型分析平台；在评估其诊断应用价值之前，仍需在帕金森病患者样本及相应对照组中开展临床验证。

章节摘要

材料与方法

本研究已获卡夫卡斯大学医学院伦理委员会批准（KAü-TFEK 2025/07/03）。所采集样本经离心处理，所得血清样本按50 μL分装，并保存于?20 °C直至使用。电化学测量采用IviumStat电化学工作站（Ivium Technologies，荷兰）在传统的三电极体系中进行，该体系由金工作电极、Ag/AgCl参比电极和铂丝对电极组成

结果与讨论

采用循环伏安法（CV）和电化学阻抗谱（EIS）对基于CRISPR-dCas13a的电化学生物传感器的逐步构建过程进行了评估（图2A和B）。裸金电极表现出最高的伏安电流和最小的Nyquist半圆，这与洁净导电表面上的快速电子转移相一致。MUA修饰降低了CV峰电流并增大了Rct，因为脂族自组装单分子层限制了氧化还原探针与电极的接触。PAMAM-G4的偶联则改变了

结论

总体而言，电化学、光谱及形貌表征结果共同支持了MUA/PAMAM-G4/dCas13a–sgRNA传感界面的逐步构建。该生物传感器在5–400 pM范围内对miR-331-5p产生了浓度依赖性的阻抗响应，最终校准方程为y = 937.0 + 3.796x（R² = 0.9940），检测限（LOD）为7.82 pM，定量限（LOQ）为23.71 pM。对评估的非靶miRNA的响应较低，表明dCas13a–sgRNA具有序列依赖性的识别能力

CRediT作者贡献声明

?rem Yi?it：撰写——初稿、研究、形式分析、数据管理。Burcu Azrak：监督指导、研究、形式分析、概念构思。Zihni Onur Uygun：撰写——初稿、监督指导、研究方法、研究、经费获取、概念构思。

声明

作者声明不存在利益冲突。

利益冲突声明

作者声明以下财务利益/个人关系，可能被视为潜在的利益冲突：Zihni Onur Uygun报告了由土耳其科学技术研究委员会（TüB?TAK）提供的资金支持。Zihni Onur Uygun报告了与土耳其科学技术研究委员会的关系，其中包括：资助项目。如有其他作者，他们声明不存在已知的竞争性财务利益或个人关系

致谢

本研究由土耳其科学技术研究委员会（TüB?TAK）（土耳其）资助，项目编号为125Z814。

?rem Yi?it|Burcu Azrak|Zihni Onur Uygun